Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Resumo

Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.

Resumo

Peter Karlson e Lüscher Martin usou o termo feromônio pela primeira vez em 1959 para descrever ^um produtos químicos utilizados para a comunicação intra-espécies. Feromônios são voláteis e não-voláteis de curta duração moléculas secretadas ² e / ou contidas em fluidos biológicos ^3,4, como a urina, um líquido conhecido por ser a principal fonte de feromônios ^3. Comunicação pheromonal está implicado em uma variedade de modalidades de animais chave, tais como interações familiares ^5,6, organizações hierárquicas ³ e ^7,8 interações sexuais e são, consequentemente, diretamente correlacionado com a sobrevivência de uma dada espécie ^9,10,11. Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (VNO) ^10,12, uma estrutura pareada localizada na base da cavidade nasal, e fechado em uma cápsula cartilaginosa. Cada VNO tem uma forma tubular com um lúmen ^13,14 permitindo o contato com o externomundo químico. O neuroepitélio sensorial é composto principalmente de neurônios sensoriais bipolares vomeronasal (VSNs) ^15. Cada VSN estende um único dendrito para o lúmen que termina em um botão dendríticas grande influência até 100 microvilosidades implicados na detecção química ^16. Subpopulações de numerosos VSNs estão presentes. Eles são diferenciados pelos quimiorreceptores eles expressam e, portanto, possivelmente pelo ligante (s) que reconheçam ^17,18. Duas principais famílias receptor vomeronasal, V1Rs e V2Rs ^19,20,21,22, são compostas respectivamente por 240 e 120 ^{23 24} membros e são expressos em camadas separadas do neuroepitélio. Receptores olfativos (ORs) ²⁵ e receptores de peptídeos formil (FPRs) ^26,27 também estão expressos em VSNs.

Ou não essas subpopulações neuronais use o caminho downstream mesmo sinalização para feromônios de sensoriamento é desconhecida. Apesar de um papel de destaque desempenhado por um cálcio permeável canais (TRPC2) presentes na microvilosidades de neurônios maduros TRPC2 ²⁸ canais de transdução independentes têm sido sugeridas ^6,29. Devido ao elevado número de sub-populações neuronais ea morfologia peculiar do órgão, investigações farmacológicas e fisiológicas dos elementos de sinalização presente no VNO são complexas.

Aqui, apresentamos uma preparação fatia aguda do tecido do VNO do mouse para a realização de exames imagiológicos de cálcio. Esta abordagem permite observações fisiológicas, no ambiente natural de um tecido vivo, de subpopulações geral ou individual de VSNs previamente carregado com Fura-02:00, um corante de cálcio. Este método também é conveniente para estudar qualquer GFP-tagged receptor de feromônio e é adaptável para o uso de outras sondas fluorescentes de cálcio. Como exemplo, usamos aqui um rato VG linha ^30, em que a tradução do receptor de feromônio V1rb2 está ligada à expressão de GFP por uma estratégia polycistronic.

Protocolo

1. Dissecção da VNO do mouse

1. Use ratos adultos. Como feromônio de sensoriamento está implicado em multimodalities, cuidadosa distinção entre as linhagens, os genótipos, sexos e idades é importante e vai influenciar os resultados. Aqui, escolhemos ratos adultos VG ³⁰ anteriormente utilizado para a identificação de um par receptor de feromônio-(2-heptanona-V1rb2) ³¹ (Fig. 1A).
2. Antes de iniciar a dissecção, prepare limpa e fria fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO ₃ mM 25, D-Glicose 10 mM, KCl mM 2, MgCl _{2 2} mM, NaH ₂ PO ₄ 1,2 mM, CaCl _{2 2} mM, pH 7,4) saturado com oxycarbon (95% O _2: 5% CO _2). Para isso, misturar todos os componentes, exceto ACSF CaCl _2. Saturar a solução diretamente borbulhando com oxycarbon. No final, adicione o CaCl ₂ e ajuste com DDH ₂ 0 para o volume desejado. Manter a solução ACSF em gelo até use.
3. Eutanásia do mouse deve ser preferencialmente feito por deslocamento cervical ou por inalação de CO _2, pouco antes do experimento.
4. Cortar a cabeça de rato. Colocá-lo sob um microscópio de dissecação em ACSF frio continuamente oxycarbonated.
5. Cortar o maxilar inferior e posição da cabeça, a fim de visualizar o palato (Figura 1B).
6. Faça uma incisão horizontal na parte superior do palato (Figura 1B) com uma tesoura micro e remover a membrana paladar com micro pinças de dissecação. Hidratar e limpar a cavidade exposta com ACSF (Fig. 1C).
7. Corte a parte superior ea parte inferior do septo nasal (Fig. 1C). Delicadamente extrair o septo nasal contendo o VNO e colocá-lo diretamente no ACSF no gelo (Figura 1D).
8. Separadas verticalmente as duas partes do VNO usando micro pinças de dissecação e delicadamente retire a cápsula cartilaginosa do VNO (Fig. 1E). Certifique-se de que todas as peças cartilaginosas são removidos.

2. VNO preparação fatia do tecido

O VNO preparação fatia do tecido descrito nesta seção 2) deve-se principalmente para as investigações de imagens de cálcio. Fatias VNO pode também ser usado para immunohistostainings em fatias flutuante para verificar a integridade estrutural do tecido (ver secção 3) do protocolo).

1. Prepare ponto de fusão baixo agar (3% no padrão PBS) e seu local de trabalho. Você vai precisar de ACSF, um micrótomo e suporta, micro pinças de dissecação, a incorporação de moldes (22 x 22 x 20 mm), toalhetes de precisão, escovas, placas de cultura de tecidos, cyanacrylat cola, gelo e um termômetro.
2. Encher o molde com a incorporação de 3% agar ponto de fusão baixo. Certifique-se que a temperatura não é maior do que 41 ° C antes de colocar na vertical do VNO logo enxugou (Fig. 2A) para ser capaz de obter cortes coronais.
3. Coloque o molde de incorporação no gelopara 1 min, até a solidificação e depois separá-lo do bloco de agar. Cortar o bloco de ágar-ágar numa forma piramidal e colocá-lo com cola com o apoio micrótomo (Fig. 2B).
4. Cortar fatias coronal VNO com o micrótomo, com uma velocidade de 0,5 mm / s, uma amplitude de 0,7 mm e uma espessura de 100 mm em ACSF frio e recolher as fatias de tecido com um pincel antes de colocá-los em uma placa de cultura de tecido cheio de frio ACSF.
5. Se o seu fatias contêm fluorescência endógena como GFP (em gene-alvo os neurônios), você pode selecioná-los sob um estereomicroscópio fluorescente (Fig. 2C).

3. Imunohistoquímica em fatias VNO flutuante

O objetivo deste procedimento é para verificar a integridade das fatias de tecido VNO obtidos na seção 2). Tubulina-acetilado é um marcador de microtúbulos / citoesqueleto expressa em dendritos e microvilosidades de neurônios sensoriais VNO. Para experimentos com imagens de cálcio, vá direçãoqüentemente a seção 4) do protocolo. O método immunohistostaining em fatias flutuante VNO pode ser adaptado para a avaliação da expressão de qualquer proteína de interesse. Para este fim, recomendamos que você corrigir o VNO por 1h a 4 ° C em uma solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,6) após o ponto 1.7) do protocolo e usar a partir deste ponto em PBS pH 7,6, em vez de ACSF solução.

1. Na placa de cultura de tecidos, corrigir o seu fatias de interesse em uma solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C.
2. Bloco fatias seu tecido durante a noite a 4 ° C em uma solução de PBS contendo NGS (soro normal de cabra) 10% e triton X-100 a 0,5%.
3. Incubar as fatias com o anticorpo primário (anti-acetilado-tubulina, Mouse, 1:2000) por 16h em temperatura ambiente (RT) em uma solução de PBS contendo NGS 5% e Triton X-100 em 0,25%.
4. Lavar 3 vezes por 5 minutos com uma solução de PBS contendo 2% NGS.
5. Incubar no escuro com o secoanticorpo ndary (Cy5 conjugada Goat anti-mouse, 1:200) em uma solução de PBS contendo 2% NGS por 1h em temperatura ambiente.
6. Lavar 3 vezes durante 5 minutos com PBS contendo NGS 2%, PBS NGS 1% e PBS apenas.
7. Monte seu fatias em uma mídia fluorescentes de montagem (contendo ou não DAPI), colocando-os no centro das zonas delimitadas hidrofóbica (use uma caneta hidrofóbica) e cubra com as fatias de lamelas.
8. Fazer observações e aquisições com microscopia confocal e um software que permite reconstruções em 3D (Fig. 2D-F).

4. Imagem de cálcio em fatias VNO

1. Os procedimentos a seguir terá lugar no escuro. Fatias incubar VNO por 1h a 37 ° C em uma solução de carregamento composto por ACSF frio com Fura-02:00 (7 mM; solução estoque de 1 mM em DMSO) e 0,1% PLURONIC (w / v, solução estoque em 20% em DDH ₂ O).
2. Manter as fatias carregado no gelo com oxycarbonation até o uso. Fatias carregado pode ser mantida por3-4h.
3. Coloque as fatias carregado com um pincel em uma câmara de perfusão contendo ACSF e manter as fatias com uma âncora fatia do tecido (Fig. 3A).
4. Coloque a câmara de perfusão no palco de um microscópio de imagem de cálcio (Fig. 3B) e continuamente perfundir com ACSF oxycarbonated na RT. Temperatura pode ser adaptado com o uso de um controlador de temperatura bipolar.
5. Observações das fatias carregado VNO (Fig. 3C-E) são realizadas com um microscópio invertido de fluorescência, com um objetivo 25x ou 63x e uma câmera SNAP-HQ CooL. Iluminação é feito sequencialmente (340/380 nm) com um instrumento policromador e gravadas a uma taxa de 5Hz. Emissão filtrada é feito em 510 nm. Alterações de cálcio intracelular ratio (ΔF = 340 nm/380 nm) são monitorados com um software apropriado.
6. Chemostimulation devem ser selecionados de acordo com sua própria finalidade experimental. Aqui, perfusões de ACSF contendo um feromônio mix (isobutylamine, 2-heptanona, 4-heptanona, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farneseno, 10 ^-6 M), 2-heptanona (10 ^-6 M) ou recém-coletados masculino e feminino (1: 1) urina do rato (1:100) são realizados ^32. Perfusão da ATP (125 M) é usado como um teste de viabilidade no final dos experimentos (Fig. 3F) e deve indicar uma proporção de aproximadamente 80% neurônios viáveis. Sob essas condições, as fatias podem ser utilizados até 2 horas.
7. Subpopulações GFP-tagged dos neurônios sensoriais são visualizados através de iluminação específica (neste caso, os neurônios V1rb2 expressando) e podem ser analisados ​​com precisão (Fig. 3G-I).

5. Resultados representativos:

Para estabelecer um ensaio funcional para investigar a transdução de várias vias de tomar lugar no VNO mouse, ou para identificar novas feromônio receptor-pares, aproveitamos o mouse VG linha (Fig. 1A (Fig. 1E), nos preparamos fatias aguda VNO (Fig. 2C). Fixamos uma fração deles, a fim de verificar e validar a integridade tissular da preparação através da realização de immunohistostainings contra a proteína tubulina-acetilado (Fig. 2D-F). A outra fração das fatias é usado para experimentos com imagens de cálcio. Para isso, as fatias são carregados com Fura-02:00 (Fig. 3C-E) e do nível de cálcio intracelular de cada neurônio é monitorado como uma relação ΔF (Fig. 3F). Viabilidade dos neurônios é avaliada pela perfusão da ATP (125 mM), após o que aumento rápido e transitório da relação ΔF é esperado (Fig. 3F). Urina sendo uma importante fonte de feromônios, a perfusão de frescoly urina do rato coletados (1:100) é usado como um controle endógeno. Ele dispara transientes de cálcio em aproximadamente 50% dos neurônios registrados (célula 1 e 2, fig. 3F). GFP sob iluminação, V1Rb2 neurônios positivos são observáveis, e perfusão de seu ligante conhecido pheromonal, 2-heptanona, inicia a ativação celular (célula 1, fig. 3I). Curiosamente, ativações neuronais também são observáveis ​​em uma fração de neurônios que não expressam o receptor V1Rb2 (neurônios GFP negativo) (célula 2, fig. 3I), demonstrando a complexidade do feromônio de codificação no VNO.

Figura 1. Dissecção do órgão vomeronasal do mouse. (A) do mouse A partir da linha de VG. (B) Após a eutanásia do mouse, a cabeça cheia é colocado sob um microscópio binocular e da mandíbula inferior é removida, a fim de visualizar o paladar. Uma pequena incisão horizontal é feita(Linha tracejada preta). (C) Após a remoção do palato, o septo nasal alinhado com o VNO é cortada na parte superior ea parte inferior (branco linhas tracejadas) para facilitar a extração VNO. (D) O VNO é posicionado em solução ACSF e separados (inserir: Vista poder maior das duas partes). (E) A cápsula cartilaginosa do VNO é delicadamente removida eo VNO sem sua cápsula cartilaginosa é utilizado para o resto dos experimentos. Barras de escala são: BE, 1 mm.

Figura 2. Rato vomeronasal preparação fatia aguda e integridade tissular. (A) O VNO mouse é verticalmente integrado em uma solução ágar 3%. A temperatura do ágar deve ser inferior a 41 ° C. (B) O bloco de agar é cortado em forma piramidal e 100 seções M VNO (linha tracejada preta) são gerados em ACSF. (C) fatias VNO pode ser selecionado em um estereomicroscópio fluorescentes, a fim de visualizar uma específicapopulação de tag neurônios sensoriais. (DF) Integridade Tissular pode ser avaliada por immunohistostainings contra a proteína tubulina-acetilado, uma visão maior potência do gene-alvo V1rb2 neurônios demonstrar a perfeita conservação da preparação. Neurônios com seus dendritos de longo alcance a superfície do lúmen (E), bem como a expressão da proteína estrutural nos botões dendríticas e microvilosidades podem ser observados (F). Barras de escala são: B, 5 mm; C, 60 mm; D, 40 mm; EF, 20 mM.

Figura imagens de cálcio 3. E detecção de feromônio no vomeronasal fatias de tecido aguda. (A) Depois de um Fura-2:00 fase de carga, fatias VNO são colocados em uma câmara de perfusão e são mantidas com uma âncora adaptado (vista de alta potência). (B) Os experimentos são realizados no escuro e fatias VNO são continuamente perfundidos com ACSF de RT com um sistema de vácuo. A temperatura pode ser chosen usando um sistema controlador de temperatura composto por um elemento Pelletier bipolar e uma sonda térmica. Essa experiência foi realizada em temperatura ambiente. (CE) fatias VNO são observáveis ​​sob contraste de fase Hoffman (C, Hv) ou iluminação nm Fura 380 antes (D) e durante a ativação neuronal (E, aqui com ATP). (F) a viabilidade neuronal é avaliada com perfusão de ATP (125 mM). Aqui, chemostimulation é feito com urina (urina, 1:100) ou com uma mistura de feromônios mouse (ph mix., 10 ^-6 M) a uma vazão constante de 165 ml / h. Níveis de cálcio intracelular (ΔF) podem ser gravadas individualmente para cada célula (Cell 1-3). (G) Um neurônio V1Rb2 é visualizado sob iluminação GFP (1). (H) O carregamento deste neurônio (1), bem como um neurônio não expressar V1rb2 (2) é mostrado. (I) O neurônio V1rb2 é capaz de responder a 2-heptanona com um aumento de cálcio intracelular. Este neurônio não V1rb2 especial expressando também responde a 2-heptanona (célula 2). Barras de escala são: CE, 20 mm; GH,15 mm; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F e I) Duração da aplicação do estímulo é indicado por barras em cada traço. A escala de cores arbitrárias representa a intensidade de fluorescência.

Discussão

O método de imagem de cálcio apresentado aqui permite gravar, em uma preparação fatia aguda, as respostas dos neurônios de rato pheromonal VNO. Com esta abordagem, a dissecção do animal para os neurônios vomeronasal é, com alguma prática, facilmente alcançável e oferece uma preparação de tecido de longa vida. Ele permite demorado experimentos como estudos farmacológicos ou o estudo de codificação pheromonal. Com esta técnica fisiológica, grandes populações, bem como precisa subpopulações neuronal pode ser analisado especificamente. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado às abordagens imuno-histoquímica ou experimentos com base em corantes de cálcio outros. O uso destas metodologias combinadas certamente irá permitir a identificação de novos ligantes pheromonal para os quimiorreceptores muitos órfãos expressas no órgão vomeronasal do mouse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Adenosina 5'-trifosfato dissódico solução salina (ATP)	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO
Agar	Sigma-Aldrich	A7002-100G	Preferencialmente por imuno-histoquímica
Agar (ponto de fusão baixo)	Sigma-Aldrich	A0701-25G	Preferencialmente para imagens de cálcio
CL-100 Controlador de Temperatura Bipolar	Warner Instruments	W64-0352
Microscópio confocal	Leica Microsystems	SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	ImmunoResearch Jackson	115-175-071	Proteger da luz
DMSO (dimetil sulfóxido)	Merck	317275-100ML
Incorporação de moldes, Peel-A-Way	Polysciences	18646A-1	22 x 22 x 20 mm
Fluorescentes de montagem de mídia (Vectashield com DAPI, 10 ml)	Rectolab	H-1200
FURA-02:00	Teflabs	0103	Proteger da luz
Glisseal N (graxa de vácuo, 60 g)	Chemie Borer	Glisseal N
Câmara de gravação grande banho (RC-26G)	Warner Instruments	64-0235
MetaFluor (software para criação de imagens de cálcio; v.7.6.5.0)	Sistemas Visitron
Monoclonal anti-tubulina acetilam,d anticorpo do rato	Sigma-Aldrich	T6793-.2ML
Normais de cabra soro (NGS, 10 ml)	Interchim	UP379030
Plataforma de câmaras (P-1)	Warner Instruments	64-0277
PLURONIC F-127, 2 g	Invitrogen	P-6867
Roti Coll (frasco dosador, 10 g)	Carl Roth	0.258,1
SC-20 aquecedor Solução Dual In-line / Cooler	Warner Instruments	W64-0353
Âncora fatia (SHD-26GKIT)	Warner Instruments	64-0266
Microscópio Stereofluorescence	Leica Microsystems	MZ16FA
Super PEN PAP (hidrofóbicoscaneta)	Pelco Internacional	22309
Triton X-100	Fluka	93420-250ML
Vibrando blade micrótomo VT 1200S	Leica Microsystems	14048142066
VisiChrome policromador sistema de alta velocidade	Sistemas Visitron
3D Visualização de Dados (Imaris; v.6.3.1)	Bitplane Software Científico