Um Modelo contundente de lesão da medula espinhal cervical unilateral Usando o Impactor horizonte infinito

Resumo

Uma maneira confiável e repetível para produzir uma lesão da medula espinhal cervical unilateral utilizando o pêndulo horizonte infinito é descrito. O método leva vantagem de um quadro projetado e grampo para estabilizar a coluna. O procedimento padronizado e biomecânica lesão os parâmetros resultam em lesões suficientes e sustentados.

Resumo

Embora a maioria dos humanos lesões da medula espinhal ocorrer na medula cervical, a grande maioria da pesquisa de laboratório emprega modelos animais de lesão da medula espinal (SCI), na qual o cabo vertebral torácica é ferido. Além disso, porque a maioria dos humanos lesões da medula ocorrer como resultado de romba, trauma não penetrante (acidente de veículo automóvel, por exemplo, lesões desportivas) onde a medula espinal é violentamente atingido por osso deslocado ou tecidos moles, a maioria dos investigadores SCI são da opinião que a maioria dos modelos de lesão clinicamente relevantes são aqueles em que a medula espinal é rapidamente contundido. ¹ Portanto, um passo importante para a avaliação pré-clínica de novos tratamentos no seu caminho para a tradução humana é uma avaliação da sua eficácia num modelo de contusão SCI dentro A medula cervical. Aqui, descrevemos os aspectos técnicos e consequentes resultados anatômicos e comportamentais de um modelo unilateral contundente da cervical SCI que emprega oHorizonte Infinito impactor lesão medular.

Ratos Sprague Dawley foram submetidos a uma laminectomia unilateral do lado esquerdo no C5. Para optimizar a reprodutibilidade dos resultados biomecânicos, funcional e histológica do modelo de lesão, contundido as medulas espinais, utilizando uma força de impacto de 150 kdyn, uma trajectória de impacto de 22,5 ° (animais rodado a 22,5 °), e um local de impacto fora da linha média de 1,4 mm. A recuperação funcional foi avaliada através do cilindro de criação, teste escada horizontal, preparação e teste modificado Montoya escadaria até 6 semanas, após o que as medulas espinhais foram avaliados histologicamente para poupador substâncias branca e cinzenta.

O modelo de lesão aqui apresentado transmite consistentes e reprodutíveis forças biomecânicas para a medula espinal, uma característica importante de qualquer modelo experimental SCI. Isto resulta em danos histológica discreta para a metade lateral da medula espinal, que é em grande parte contido em tele lado ipsilateral da lesão. A lesão é bem tolerado pelos animais, mas não resulta em déficits funcionais do membro anterior, que são significativa e sustentada nas últimas semanas após a lesão. O modelo de lesão cervical unilateral apresentado aqui pode ser um recurso para pesquisadores que desejam avaliar terapias potencialmente promissores antes da tradução humana.

Protocolo

1. Configure: Frame e Design Pinça para Segurar o Animal

1. A moldura e grampo para prender o animal foi customizado para acomodar o horizonte infinito (IH) Impactor de lesão medular.
2. A base do quadro é uma plataforma de alumínio cortado em as seguintes dimensões (30,2 cm x 20,3 cm x 1,3 cm), a fim de se encaixar no suporte de guia tabela que vem padrão com o dispositivo IH (Figura 1A).
3. Quatro Flexaframe placas de apoio do pé (Fisher Scientific, Toronto, ON) estão ligados à plataforma e oito hastes Flexaframe de apoio (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30,5 cm) são montados utilizando oito conectores Flexaframe de apoio (Figura 1B).
4. Dois conectores Flexaframe de suporte adicionais, inerentes aos valores médios duas varas, a casa feita sob encomenda vale para o grampo (Figura 1B).
5. O ângulo pelo qual medula espinal do animal é rodado em relação à vertical é estabelecida por keeping uma da haste horizontal no lugar e variando a altura da haste de outro horizontal (Figura 2).
6. O grampo é 35,6 milímetros de comprimento, 25,4 milímetros de altura e com uma mandíbula milímetros 7,6 concebido para agarrar rigidamente sob o processo transverso de C4 a C6 (Figura 1C). Detalhes adicionais sobre o desenho grampo têm sido descritos anteriormente por Choo et ai., 2009.

2. Cirurgia

1. Macho Sprague Dawley (Charles River Laboratories) pesando 300-350 g foram anestesiados com isofluorano (4% para a indução e 2% para manutenção) em oxigénio (1 L / min).
2. Uma vez que os animais estão sob o plano da anestesia, o animal é colocado em um quadro estereotáxico (Kopf, Tujunga, CA).
3. Para minimizar a hemorragia durante a cirurgia mL procedimento de lidocaína 0,4 (20 mg / mL; Bimeda - MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Canadá) com epinefrina é injectado por via intramuscular em torno do local cirúrgico no dorsoregião do pescoço l.
4. Um 4-5 centímetros incisão na linha média dorsal é feita usando um bisturi estéril (# 15), a partir da base do crânio e estendendo caudalmente.
5. Pinças esterilizadas Adson sem rodeios são utilizados para dissecar através da musculatura dorsal para alcançar a coluna, e um afastador Alm estéril (Ferramentas Ciência Belas, North Vancouver, BC) é inserido para manter os músculos separados.
6. Usando o bisturi # 15, os músculos sobreposição de lâminas de C4-C7 são raspadas, iniciando na linha média e varrendo-os lateralmente.
7. Uma incisão com um bisturi estéril (# 15) é feita para o músculo ligado aos processos transversais em ambos os lados da espinha, a fim de encaixar a braçadeira por baixo dos processos transversais de C4 a C6.
8. Com uma multa estéril ponta Friedman-Pearson Rongeur (Ferramentas Ciência Belas, North Vancouver, BC), a lâmina C5 esquerda é cuidadosamente removida para visualizar a dura ea medula espinhal.
9. Uma haste com um diâmetro de 1,5 mm é deslizado por baixo dos braçospara sustentar o animal para cima, elevando assim a coluna um pouco e facilitar a inserção de fixação.
10. Monte a mandíbula da pinça estéril para laterais processos transversos de C4 a C6 e aperte os parafusos.
11. Retire o afastador Alm.

3. Lesão Medular

1. Depois de a braçadeira é montado sobre o animal, o animal é movido para o pêndulo IH.
2. O grampo é inserida nos suportes de metal sobre as duas hastes meio da armação que foram protegidos com um ângulo de 22,5 ° fora de horizontal (Figura 2).
3. A tomada de tesoura que oferece ajustes de altura estável, (VWR, Mississauga, ON) é levantada até que o animal está plano.
4. Assegure-se que o grampo é horizontal pela colocação de um pequeno nível de cilindro na parte superior do grampo e apertando os parafusos. É importante que todos os parafusos estão apertados ea configuração é rígida, sem qualquer movimento.
5. O resto do procedimento é realizado sob uma microscope (Leica MZ8).
6. Abaixar e têm como objectivo a ponta do pêndulo (15 mm de diâmetro, com arestas arredondadas), utilizando o botão de ajuste vertical e os dois botões de ajuste horizontal no pêndulo IH até que o centro da ponta do pêndulo paira acima do vértice do C6 processo espinal.
7. Uma vez que a ponta do pêndulo está centrada, girar o botão de ajuste do eixo y um e dois por sua vez, quinto (1,4 mm) para mover a ponta lateralmente para o lado esquerdo e do eixo x botão de ajuste horizontal para mover a ponta do pêndulo para o centro do C5.
8. Abaixar a ponta até que é um pouco acima da dura a fim de verificar que a ponta do pêndulo é destinada a metade lateral da matéria cinzenta.
9. Gire o botão de ajuste vertical de duas voltas para levantar a ponta 4 mm acima da dura-máter.
10. Certifique-se que a área de impacto é seca utilizando um cotonete ou vara.
11. Definir a força desejada a 150 kdyn sobre o programa e clique em "Iniciar Experiment" para acionar o pêndulo.
12. Após a lesão, a ferida é fechada em layers com Vicryl 5-0. A buprenorfina (0,03 mg / kg SC, Temgesic; Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) e solução salina (10 mL) é administrada por via subcutânea duas vezes ao dia antes e durante dois dias após a cirurgia. Os animais são cuidadosamente monitorizados duas vezes por dia durante 2 semanas e uma vez por semana durante 6 semanas pós-lesão.

4. Os resultados representativos

Vinte e nove macho Sprague Dawley (Charles River Laboratories) pesando 300-350 g foram feridas com uma definição de força de 150 kdyn. A ponta do pêndulo foi destinado 1,4 milímetros lateral à linha mediana, a um ângulo de 22,5 ° fora da vertical. A força média real foi de 155,55 ± 0,73 kdyn. O deslocamento média foi de 1512,72 ± 27,86 uM ea velocidade foi 120,24 ± 0,52 mm / s (Figura 3).

Desfechos Comportamento

A recuperação funcional foi avaliada utilizando a horizontal escada, teste de criação do cilindro, da preparação de teste,e modificado Montoya teste escada ^1. Os animais foram treinados antes da lesão e avaliada em 2, 4 e 6 semanas pós-lesão. Houve prejuízos forelimb significativas sofridas ao longo do período experimental.

Teste de Escada Horizontal. Antes da lesão, os animais feita apenas 4,75 ± 0,73% erros no membro anterior ipsilateral ao percorrer toda a escada espaçadas irregularmente horizontal. Após a lesão, os animais demonstraram aumento significativo na porcentagem de erros membro anterior. Os erros por cento ipsilaterais forelimb foram 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% e 22,06 ± 2,05% a 2, 4 e 6 semanas após a lesão, respectivamente (Figura 4A). Importante, a insuficiência forelimb sobre este teste foi mantida durante as 6 semanas.

Criação de teste do cilindro. O percentual de forelimb ipsilateral (esquerdo + ambos) o uso durante a exploração diminuiu significativamente após a SCI.Antes da lesão, os animais utilizados no membro anterior ipsilateral 75,12 ± 2,25%. Após a lesão, os animais utilizados no membro anterior ipsilateral 8,59 ± 1,80% em 2 semanas, 14,25 ± 2,65% a 4 semanas e 11,76 ± 2,66% em 6 semanas (Figura 4B).

Modificado Montoya teste Staircase. O número de pelotas recuperados com o membro anterior ipsilateral diminuiu drasticamente após a lesão. Antes da lesão, os animais recolhidos 84,85 ± 2,88% das recompensas alimentares. No entanto, aos 2, 4 e 6 semanas após a lesão, os animais recuperados somente 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% e 25,86 ± 3,09% das pelotas (Figura 4C).

Higiene teste. Houve quedas dramáticas nos escores de cuidados especiais após a lesão. Depois de SCI, as pontuações ipsilaterais coçar foram 2 semanas: 2,00 ± 0,17, 4 semanas: 1,83 ± 0,17 e 6 semanas: 1,79 ± 0,11 (FIGUre 4D).

Resultados histológicos

A massa branca e poupadores matéria Grey. Um exemplo de uma lesão da medula espinal, a uma força de 150 kdyn, o ângulo de 22,5 ° e têm como objectivo lateral de 1,4 milímetros é apresentada na Figura 5. A lesão resultou em danos substanciais à substância branca e cinzenta no lado ipsilateral. Ambos corticoespinhal e vias rubroespinal ficaram feridas e 23 dos 29 animais apresentaram lesão parenquimatosa contido no lado ipsilateral. A extensão longitudinal do dano da matéria branca e cinzenta foi 2400 e 2400 rostralmente caudalmente (Figura 6). Ao adicionar as seções para fornecer uma estimativa grosseira do "spread cumulativo" de branco e cinza poupador matéria (2000 mM rostral e caudal do epicentro), o lado ipsilateral teve apenas 51,8% da substância branca poupado e 39,7% da massa cinzenta comparados remanescente para o lado contralateral (Figura 6).

Figura 1. Horizonte Infinito impactor lesão medular. A. Impactor horizonte infinito e global definida. B. Quadro configurar. C. imagem Close-up do grampo para a realização de processos transversos cervicais. D. Especificação (unidade: polegada) do grampo. Tolerância sugerida <0,002 em (Choo et al. De 2009). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. A. Moldura ilustração e correspondente configurado para atingir a rotação da medula espinal de 0 ° (neutro) ou B. 22,5 °, com o objectivo lateral de 1,4 mm.

Figura 3. Força representativa e gráficos de deslocamento para impactor horizonte infinito. A seta indicates o tempo em que a ponta do pêndulo atingiu 20 kdyn eo ponto quando a gravação de deslocamento é iniciada. A força real é lido a partir do pico da curva de força versus tempo eo deslocamento correspondente é calculado. Os gráficos abaixo mostram uma típica 150 contusão kdyn, Deslocamento A. vs gráfico de tempo, B. Força vs gráfico Time. Estes gráficos mostram que a força real obtido foi de 152 kdyn, eo deslocamento do pêndulo para a medula foi medido como sendo de 1287 uM. para ver figura maior .

Figura 4. Avaliações comportamentais para a força de 150 kdyn, angulação do pêndulo de 22,5 ° e têm como objectivo de 1,4 mm à esquerda da linha média. A. Teste de escada horizontal. B. teste criação do cilindro. C. Modificado teste escadaria Montoya. D. Higiene teste. O membro anterior ipsilateral resultou em significativa e SusNed deficiências em comparação com o membro anterior contralateral.

Figura 5. Imagens representativas da medula lesionada de rostral caudal de 1600 mm a 1600 uM.

Figura 6. Avaliações histológicas. A. Matéria por cento branco e cinza poupado. Importa cerca de 2000 mM de o epicentro da lesão foi em grande parte poupada. B. cumulativa branco e cinza assunto poupado com 2.000 mM de o epicentro da lesão. O lado ipsilateral tinham significativamente menos poupado substâncias branca e cinzenta em relação ao lado contralateral. Clique aqui para ver maior figura .

Discussão

Neste artigo, descrevemos um modelo de contusão cervical unilateral com o horizonte infinito (IH) impactor, a uma força de 150 kdyn, um ângulo de 22,5 ° fora da vertical, e um objectivo lateral, de 1,4 mm da linha média. Com essas configurações, fomos capazes de produzir sofridos déficits comportamentais no membro anterior ipsilateral com o rompimento do parênquima contido em grande parte para o lado ipsilateral, onde verificou-se que ocorreu um dano considerável para as regiões onde as vias rubroespinal, reticuloespinh...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Impactor horizonte infinito	Sistemas de precisão e Instrumentação	IH-0400
Folha de metal de alumínio	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Pés Flexaframe placas de suporte	Fishers Científico	1466625Q
Apoio hastes Flexaframe	Fishers Científico	1466610GQ
Flexaframe Suporte Conectores	Fishers Científico	1466620Q
Grampo 1	Custom Made		Choo et al., 2009
Titulares de metal	Custom Made		Veja acima
Impactor ponta	Custom Made		Diâmetro: 1,15 milímetros
Estereotáxica	David Kopf Instruments	Modelo 900
Nível Cilindro	Yijia FERRAMENTAS	YJ-SL0620
Microscópio	Leica		Modelo #: MZ8
Laboratório tesoura jack	VWR	12620-902