Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Resumo

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Resumo

TGF-β tem papéis opostos na progressão do câncer de mama, agindo como um supressor de tumor na fase inicial, mas estimulando a invasão e metástase na tarde ^1,2 palco. Além disso, o TGF-β é freqüentemente overexpressed no câncer de mama e sua expressão se correlaciona com o prognóstico pobre e metástases ^3,4. Os mecanismos pelos quais TGF-β induz a invasão não são bem compreendidos.

TGF-β provoca suas reações celulares via TGF-β tipo II (TβRII) e eu tipo (TβRI) receptores. TGF-β sobre induzida por formação heteromeric complexo, TβRII fosforila o TβRI. O TβRI ativada inicia a sua via de sinalização intracelular canônica pela Smads receptor fosforilar (R-Smads), ou seja Smad2 e Smad3. Estes ativados R-Smads formam complexos com heteromeric Smad4, que se acumulam no núcleo e regulam a transcrição de genes-alvo ^5. Além do anteriormente dvia Smad escribed, os resultados receptor de ativação na ativação de diversas outras organizações não-Smad vias de sinalização, por exemplo Mitógeno proteína quinase ativada (MAPK) Vias ^6.

Para estudar o papel da TGF-β em diferentes estágios do câncer de mama, fizemos uso do sistema de célula MCF10A. Este sistema é composto de células espontaneamente imortalizado MCF10A1 (M1) de mama epiteliais ^7, o H-RAS transformou M1 derivados MCF10AneoT (M2), que produz lesões pré-malignas em camundongos ^8, eo MCF10CA1a M2 derivados (M4), que foi estabelecida a partir de xenoenxertos M2 e os formulários de alto grau de carcinomas com a capacidade de metástase para o pulmão ^9. Esta série MCF10A oferece a possibilidade de estudar as respostas de células com diferentes graus de malignidade que não são influenciados por uma base genética diferente.

Para a análise de TGF-β induzida por invasão, geramos homotypic MCF10A esferóide celular embe culturasdded em uma matriz de colágeno 3D in vitro (Fig. 1). Tais modelos se assemelham tumores humanos in vivo, estabelecendo um gradiente de oxigênio e nutrientes, resultando em células ativas e invasiva sobre as células fora e quiescente ou mesmo necrose no interior dos ¹⁰ esferóide. Esferóide ensaios com base também foram mostrados para melhor recapitular resistência às drogas do que as culturas em monocamada ^11. Este sistema MCF10 modelo 3D permite estudar o impacto do TGF-β sinalização nas propriedades invasivas das células de mama em estágios diferentes de malignidade.

Protocolo

1. Preparação da solução Methocel (500 mL)

1. Autoclave g 6 de metilcelulose em uma garrafa de 500 ml contendo um agitador magnético.
2. Dissolver a metilcelulose em 250 ml de DMEM/F12 pré-aquecido sem soro (60 ° C) por 20 min.
3. Adicione 250 ml de DMEM/F12 (RT), contendo soro de cavalo 10%. Misturassem durante a noite (4 ° C).
4. Clara a solução por centrifugação (5000g, 2h, 4 ° C).
5. Tome a solução clara e altamente viscoso para um novo tubo (cerca de 90-95% da solução-mãe).
6. Armazenar a 4 ° C até o uso.

2. Cultura esferóide

1. Prepare uma solução de 20% Methocel (10 ml e 40 Methocel meio de crescimento ml).
2. Lave as células duas vezes com PBS, adicionar 0,1% de tripsina e células incubar a 37 ° C
3. Ressuspender as células em meio de crescimento e contagem das células.
4. Prepare uma suspensão de 10 000 células por ml em Methocel 20%.
5. Adicione a suspensão de células para o fundo s 96 bem rodadaplacas USPENSÃO (100 l por poço).
6. No dia seguinte, verificar a formação de esferóides nas placas de suspensão. Esferóides estará pronto para uso após 1-3 dias.

3. Preparação de colágeno

1. Prepare uma solução sobre o gelo, de 8 de colágeno ml, 1 ml PBS 10x, 1 ml NaOH 0,1 N e 3 gotas 0,1 N HCl. Verifique se o pH é de 7,4 por manchar um pouco da solução em tiras indicador de pH. Ajustar o pH se fora do intervalo.
2. Adicionar 50 ml de solução de colágeno neutralizado nos poços de uma placa de 96 poços
3. Incubar a 37 ° C até que o colágeno é solidificada (90 min).
4. Prepare-Methocel colágeno ligante soluções no gelo: para cada ligante parte 1 de pipeta de solução de colágeno. Adicionar 20 ml por ng de colágeno TGF-β. Após a diluição com Methocel e difusão sobre as diferentes camadas, a concentração final de TGF-β será de 5 ng / ml Mix em vortex. Adicionar 1 parte de Methocel solução. Misturar em vortex.

4. Esferóide incorporarding

1. Coloque uma ponta de 200 mL, que tem cerca de 5 mm da ponta cortada, em uma pipeta de 200 mL. Sugar um esferóide com a pipeta e cuidadosamente dispensar o meio em um prato vazio. Observe se o esferóide fica dentro da ponta. O esferóide é visível como um ponto branco. Sem soltar o êmbolo, sugar até 100 mistura de colágeno Methocel-L e dispensar o esferóide na mistura de colágeno em colágeno revestido-96 também. Faça isso por 12 esferóides para cada condição.
2. Deixe colágeno solidificar pelo menos 30 minutos a 37 ° C
3. Remover bolhas de ar com uma ponta de 200 mL.
4. Adicionar 50 ul de meio com soro 1,6% e inibidores dissolvido em DMSO. Para SB-431542 adicione 4 ml de solução estoque (10 mM) a 1 ml de meio. Depois de difusão, a concentração final do inibidor será de 10 mM. TGF-β e inibidores vai manter o curso do experimento. Tirar fotos dos esferóides sob o microscópio usando aumento de 40 vezes.
5. Depois de 48h de estimulação com TGF-β e / ou inibidores, tirar fotos dos esferóides sob o microscópio usando aumento de 40 vezes.
6. Medir a área dos esferóides invadindo após 2 dias e subtrair a área inicial. Medir a área de um esferóide: imagem do Aberto do esferóide em Adobe Photoshop Extended (figura 2A) e selecione a ferramenta de seleção rápida (figura 2B). O ponteiro do mouse se transforma em um círculo com um 'plus' (+) sinal (figura 2C). Enquanto arrasta o cursor sobre o esferóide, Photoshop irá reconhecer as fronteiras do esferóide. Se uma área fora do esferóide é selecionada, esta região pode ser excluído da seleção pressionando a tecla Alt ou usando a ferramenta de seleção negativa que é indicado por um sinal - na barra de ferramentas (). O cursor muda para um círculo com um "menos" (-) sinal e arrastando o cursor sobre a área selecionada erroneamente, esta área é removida da seleção (figura 2D). Se necessário, várias regiões podem ser selecionados pressionando o Shift botão. Para trabalhar com mais precisão, o tamanho do ponteiro do mouse pode ser ajustada alterando o diâmetro da escova na barra de ferramentas (Figura 2E). Quando o esferóide todo é selecionada, a área da seleção é calculada através da análise MEDIDA na barra de menu ou pressionando Ctrl + Shift + M (Figura 2F). A janela de gravação de medição aparecerá mostrando o nome do arquivo e da área da seleção em pixels, assim como outros dados (figura 2G). Se várias seleções são medidos, a primeira linha mostra a soma de todas as áreas. As medições das seleções individuais são apresentados nas linhas abaixo. Os dados de todas as medições podem ser exportados para um arquivo de texto e aberto em Excel.

5. Resultados representativos:

Um exemplo do ensaio esferóide com MCF10A1 (M1), as células epiteliais mamárias normais, H-RAS transformou MCF10AneoT (M2) e M2 células derivadas MCF10CA1a (M4) é dada na Figura 3. Células M1 apresentaram apenas invasão fracos semestimulação, mas invadiu significativamente melhor após estimulação por TGF-β. Em contraste, a RAS-transformado M1-M2 derivados já invadiu de forma eficiente, sem adição de estímulos, e isso aumentou ainda mais vezes 4-5 sobre TGF-β tratamento. Células M4 apresentou o maior invasão, com e sem TGF-β disso.

Em seguida, examinamos se poderíamos interferir com TGF-β induzida por invasão neste modelo esferóide uso de inibidores químicos. Para isso, usou SB-431542, um análogo de ATP e inibidor seletivo da atividade da quinase de TβRI, bem como ativina tipo IB receptor (ActRIB) e activina receptor-like kinase (ALK) 7 ^12. Como esperado, SB-431542 inibiu TGF-β induzida por invasão de M1, M2 e M4 células (Fig. 4), indicando que a invasão TGF-β-induzida é TβRI kinase-dependente. Além disso, a invasão dos esferóides basal também foi fortemente inibida, sugerindo que a invasão basal também é deindependentes em TGF-β.

Figura Fluxograma 1. Do ensaio 3D esferóide. Primeiro, as células são banhados sob condições não-aderentes em placas em forma de u suspensões. Células aggregrate em esferóides multcellular e pode ser incorporado em uma matriz de colágeno. Para esta matriz de colágeno, que são capazes de invadir.

Figura 2. Quantificação da área do esferóides usando o Adobe Photoshop Extended. (A) A imagem do esferóide é aberto no Adobe Photoshop Extendend Selection (B) da ferramenta de selecção rápida (C) Arrastar o cursor sobre o esferóide para selecionar a área da remoção (D) esferóide de uma área wongly incluído usando a negativos de selecção rápida ferramenta de ajuste (E) do tamanho do pincel da ferramenta de seleção rápida de forma mais precisa selecionar a área (F) Selecção domedição de comando para gravar (G) Exemplo de um registro de medição.

Figura 3. TGF-β induzida por invasão de esferóides de MCF10A1 espontaneamente imortalizado (M1) (A), RAS-transformado MCF10AneoT (M2 (B) e seus derivados MCF10CA1a metastático (M4) (C). M1, M2 e M4 esferóides embutidas em colágeno foram tratados com 5ng/ml de TGF-β por 48h, conforme indicado. AC Representante imagens tomadas no dia da incorporação e dois dias depois. D invasão relativa diferença foi quantificada como área no dia 2 de menos dia 0. Os resultados são expressos como média ± sd Adaptado de ^13.

Figura 4. Invasão esferóide Basal e TGF-β induzida é inibida by SB-431542. Esferóides M1, M2 e M4 foram incorporados em colágeno e tratados com TGF-β 5ng/ml e / ou 10 mM SB-431542, conforme indicado. Imagens representativas tomada após dois dias (A). Invasão relativa diferença foi quantificada como área no dia 2 de menos dia 0 (B). Os resultados são expressos como média ± sd Adaptado de ^13.

Discussão

Nós estabelecemos um modelo esferóide em que MCF10A1 células e seus derivados malignos invadem em uma matriz de colágeno de uma forma TGF-β-dependente. Primeiro, esferóides são formados em placas redondas de 96 poços de fundo de suspensão na presença de metilcelulose. Naturalmente, também em forma de U poli-HEMA placas revestidas podem ser usados ​​para esta finalidade. Metilcelulose é absolutamente necessário nesta etapa, já que as células morrerão na ausência de metilcelulose. TGF-β é adicionado diretamente à mistura ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Metil celulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Avançados Biomatrix	5005-B
indicador de pH tiras	Merck	9533
De 96 poços de suspensão placas	Greiner Bio-one	650 185
De 96 poços de adesão TC placas	Greiner Bio-one	655 180