Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Summary

Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

Abstract

Vaginose bacteriana (BV) é uma síndrome recorrente polimicrobiana que se caracteriza por uma mudança na microbiota "normal" de Lactobacillus dominado a uma microbiota dominado por um número de espécies de bactérias, incluindo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e outros ^1-3. Esta condição está associada com uma série de resultados negativos de saúde, incluindo HIV aquisição ^4, e pode ser difícil de gerir clinicamente ^5. Além disso, o diagnóstico de BV tem contado com o uso de manchas Gram de esfregaço de swab vaginal que são pontuados em vários critérios numéricos ^6,7. Embora este diagnóstico é simples, barato e bem adequado para ambientes de recursos limitados, que podem sofrer de problemas relacionados com interpretações subjetivas e não dar um perfil detalhado da composição da microbiota vaginal ^8. Recentes esforços de seqüenciamento de profundidade revelaram uma rica, diversificada microbiota vaginal comdiferenças claras entre as amostras retiradas de indivíduos que são diagnosticados com BV em comparação com aqueles indivíduos que são considerados normais ^9,10, o que resultou na identificação de um número de alvos potenciais para o diagnóstico molecular da BV ^11,12. Esses estudos têm fornecido uma riqueza de informação útil, mas seqüenciamento profunda ainda não é prática como um método de diagnóstico em um ambiente clínico. Recentemente, descreveu um método para rapidamente perfil da microbiota vaginal em um formato multiplex usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes com detecção em uma plataforma Luminex ^13. Este método, como o atual Gram métodos baseados, é rápido e simples, mas acrescenta a vantagem adicional de explorar os conhecimentos moleculares decorrentes de estudos de seqüenciamento no projeto da sonda. Este método, portanto, fornece uma maneira de perfil dos microorganismos mais importantes que estão presentes em um swab vaginal que podem ser usadas para diagnosticar BV, com alta especificidade e sensibilidade compared para Gram, fornecendo informações adicionais sobre a presença e abundância de espécies de uma forma semi-quantitativa e rápida. Este método multiplex é expansível bem além do alcance dos atuais ensaios de PCR quantitativo para os organismos particular, que é actualmente limitado a 5 ou 6 ensaios diferentes em uma única amostra ^14. Importante, o método não se limita à detecção de bactérias em swabs vaginal e pode ser facilmente adaptado para rapidamente perfil quase qualquer comunidade microbiana de interesse. Por exemplo, temos recentemente começaram a aplicar esta metodologia para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico para uso em estações de tratamento de águas residuais.

Protocol

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Um diagrama esquemático representando o processo geral é apresentado na Figura 1.

1. Talão de acoplamento

Este descreve os métodos a serem utilizados para o acoplamento de sondas de oligonucleotídeos esferas de poliestireno Luminex (ver Tabela 2). Volumes são adaptados ligeiramente para a avaliação de sondas de captura de novos em uma base experimental, estes volumes são indicados entre parênteses.

1. Retire 1-etil-3-(3-dimethy....

Discussion

A especificidade da geração do sinal é de fundamental importância, você deve estar confiante de que o sinal observado reflecte verdadeiramente a detecção de amplicon gerado a partir desse organismo. Software, tais como PrimerPlex (Premier Biosoft) pode ajudar a projetar as sondas que hibridizam de forma eficiente, mas eles podem ou não podem cruzar-hibridizar espécies não-alvo. Quando primers universais PCR são utilizados, como descrito neste protocolo, é importante ter em mente que o amplicon gerado representa todos os.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome oligonucleotídeo	Companhia	Sequência 1
H279BP	Invitrogen, IDT, ou outros	Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, fosforotioato-C, E, fosforotioato-G, F, fosforotioato-A; I, inosina, Y, C ou T; R, A ou G, K, T ou G, S, C ou G.

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimida HCl (EDC)	Perfurar	22980
Fluorescentes esferas de poliestireno: Microplex microesferas (Luminex), ou Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad)	Luminex ou Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx onde xxx corresponde ao identificador de talão	Esferas magnéticas estão se tornando disponíveis para o acoplamento de oligonucleotídeos e podem oferecer algumas vantagens. Que não tenham sido julgados por esses autores.
Oligonucleotídeos de captura (5 'amino C12 modificados)	Invitrogen, IDT, ou outros	vários	Grau de pureza dessalinizada é aceitável. Seqüências das sondas de captura usado para caracterizar swabs vaginal são fornecidos no manuscrito em que este protocolo é baseado em 13.
T7exonuclease	New England Biolabs	M0263S
Estreptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Tenha o cuidado de obter alta pureza SA-PE, este número de catálogo é recomendado
Thermowell 96 placas bem PCR	Pescador	CS006509	se encaixam em ambos os termociclador de 96 poços e máquina BioPlex
Thermowell vedação mat	Pescador	CS006555	Pode ser re-utilizados; lavar com água e sabão, enxágüe bem e seque
TMAC 5M	Sigma	T3411
Bio-Plex ou Luminex instrumento	Bio-Rad ou Luminex	Bio-Rad: 171-000201
PrimerPlex software para o projeto da sonda	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	Sugerido para Luminex sonda desinal, apesar de outras plataformas de software pode ser usado

componente	mL / ensaio	ensaios μl/100	concentração final
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl 2 (Invitrogen)	2,5	250	2,5 mM
10 mM dNTP	1	100	0,2 mM de cada
H279BP, 25 mM	0,25	25	375 nM
H1612BP, 25 mM	0,75	75	125 nM
H280, 25 mM	0,25	25	375 nM
H1613,25 mM	0,75	75	125 nM
Água	34	3400	---
Totais	44,5	4450