Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.
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Artigo de método
Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estímulos visuais são detectados e transmitidos em uma ampla faixa dinâmica de intensidades de luz e mudanças de freqüência por neurônios especializados na retina de vertebrados. Duas classes de neurônios da retina, fotorreceptores e células bipolares, fazer isso usando a fita do tipo zonas ativas, que permitem a liberação do neurotransmissor sustentada e de alto rendimento em períodos de tempo longos. ON tipo misto de células bipolares (Mb) terminais na retina peixinho, que despolarizar a estímulos de luz e receber vara mista e cone de entrada de fotorreceptores, são adequados para o estudo da fita do tipo sinapses tanto devido a seu grande tamanho (~ 12/10 diâmetro mm) e aos seus inúmeros lateral e recíprocas conexões sinápticas com dendritos de células amácrinas. Acesso direto aos terminais Mb de células bipolares da retina em fatias goldfish com a técnica de patch-clamp permite a medição de Ca 2 + pré-sináptico correntes, alterações de capacitância de membrana, e inibição de feedback recíproco sináptica mediada pelo GABA <receptores sub> A e GABA C expresso nos terminais. Medições membrana pré-sináptica capacitância de exocitose permitem estudar a plasticidade de curto prazo da liberação do neurotransmissor excitatório 14,15. Além disso, a plasticidade de curto prazo e longo prazo da liberação do neurotransmissor inibitório das células amácrinas também pode ser investigado por gravações de inibição de feedback recíproco de chegar ao terminal Mb 21. Em períodos curtos de tempo (por exemplo, ~ 10 s), a inibição GABAérgica comentários recíproca a partir de células amácrinas sofre pares de pulso, depressão através de esgotamento GABA vesícula piscina 11. A dinâmica de microcircuitos sináptica da retina na camada plexiforme interna da retina podem, portanto, ser diretamente estudados.
A técnica do cérebro fatia foi introduzida mais de 40 anos atrás, mas ainda é muito útil para a investigação das propriedades elétricas dos neurônios, tanto na soma única célula, dendrite única ou axônio, e microcircuit nível sináptico 19. Tecidos que são pequenos demais para ser colado diretamente na câmara de corte são muitas vezes incorporadas no primeiro agar (ou colocado em um filtro de papel) e depois em fatias 20, 23, 18, 9. Neste vídeo, nós empregamos a técnica de agar pré-incorporação usando retina goldfish. Alguns dos gigantes terminais célula bipolar em nossa retina fatias de peixe dourado são axotomized (axônio corte) durante o processo de corte. Isso nos permite isolar única entradas terminal pré-sináptico do nervo, porque a gravação dos terminais axotomized exclui os sinais do compartimento soma dendríticas. Alternativamente, pode-se também gravar a partir de células intactas Mb bipolar, por gravação a partir de terminais ligados ao axônios que não foram cortadas durante o processo de corte. No geral, a utilização deste protocolo experimental ajudará nos estudos da fisiologia sináptica da retina, análise de microcircuito funcional, ea transmissão sináptica em sinapses fita.
Protocolo
1. Soluções externas e internas
- Prepare a solução de corte (cálcio) de solução estoque de 10x e adicione MgCl 2, CaCl 2 e D-glicose diário. A solução final consiste em 1x (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glicose, 0,2 ácido L-ascórbico, 12 HEPES. Definir o pH para 7,4 (com NaOH) e ajuste da osmolaridade para 260 mOsm (usando H 2 O e solução estoque 10x).
- Pesar 3% agar gelificação baixa temperatura (Agarose tipo VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) e misture com corte solução. Aquecer a solução agar contendo no microondas por 1-2 min, ou até que se dissolva completamente, ....
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Discussão
Um passo crítico e difícil em nosso protocolo é a transferência do pedaço de retina na solução de agar (protocolo 3.4). É necessário remover cuidadosamente o humor vítreo e solução fatia residual do pedaço da retina e transferi-lo sem distorção ou flexão. A fim de conseguir isso, usamos uma pequena espátula (21-401-25B, Fisherbrand) com uma ponta dobrada para formar um ângulo de 90 °, juntamente com uma pinça ponta angulada (11251-35, Ferramentas Ciência Fine), para posicionar a retina peça durante todo.......
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Divulgações
Nós não temos interesses concorrentes a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Fred Rieke para o seu tipo de explicação o ágar-embedded preparação fatia da retina quando começamos a usar o protocolo em nosso laboratório. Agradecemos também a Lori Vaskalis para a ilustração do esquema visão geral e as Dras. Veeramuthu Balakrishnan e Soyoun Cho para comentários úteis no texto e vídeo. Este trabalho foi financiado por um NEI-NIH RO1 concessão, e também foi parcialmente financiado por uma Research Foundation Grant Coréia financiado pelo Governo coreano [KRF-2008-357-E00032].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Agar gelificação baixa temperatura | Sigma | A0701 | Agarose tipo VII-A |
| Pipeta de patch | Precision Instruments mundo | 1B150F-4 | De paredes espessas (1,5 mm de diâmetro externo) de vidro borosilicato |
| Extrator Vertical | Narishige | PP830 | |
| Cera dental | Cavex | ||
| Tesoura primavera | Multa Ferramentas Ciência | 15003-08 | |
| 45 ° angulada pinça de ponta fina | Multa Ferramentas Ciência | 11251-35 | |
| Gilete | Personna | De dois gumes, limpa com álcool 70% e H 2 O | |
| Tubo cilíndrico | Fisherbrand | 03-338-1B | Polietileno frascos de amostra 2,5 ml |
| Hialuronidase | Sigma | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S ou VT1200S | |
| Microscópio vertical | Olimpo | BX51WI | |
| Objetiva de imersão em água-60x | Olimpo | LUMPlanFl | NA 0,90 |
| CCD da câmera | Sony | XC-75 | |
| Camera controlador | Hamamatsu | C2400 | |
| Monitorar | Sony | 13 monitor "preto e branco | |
| Seringa filtro | Nalgene | 0,2 m | |
| Micromanipulador | Instrumento Sutter | MPC-200 | |
| Amplificador lock-in | Heka | EPC-9/10 amplificadores têm emulação de software | |
| Microscópio confocal a laser girando disco | Yokogawa | CSU-X1 | Imagens de células vivas após patch-clamp gravação de células inteiras |
| Slidebook software | Inteligente de imagem Instruments (3i) | Imagem de aquisição de dados e análise | |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| Solução tampão fosfato | GIBCO | 70013 | |
| Slides Superfrost | Fisher Scientific | Slides de vidro | |
| Anti-fading agentes | Biomeda corp. | ||
| Microscópio confocal de varredura a laser | Carl Zeiss | LSM 710 | De imagem de tecido fixado |
| Espátula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
| Manuel verticais slicer | Narishige | ST-20 | |
| Oregon Verde 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca 2 + corante fluorescente sensível |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A 20501MP- | Corante fluorescente |
Referências
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF....
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Reimpressões e permissões
