Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية التي هي مناسبة للالكهربية وCA2 التصوير +. هذا الأسلوب يسمح احد لدراسة الشريط من نوع المشابك في شبكية العين باستخدام رقائق مباشرة التصحيح ، المشبك تسجيلات احد المحطات العصبية قبل المشبكي.
Abstract
تم الكشف عن المثيرات البصرية ونقل أكثر من مجموعة واسعة ديناميكية من شدة الضوء وتيرة التغيرات التي الخلايا العصبية المتخصصة في شبكية الفقاريات. طبقتين من الخلايا العصبية للشبكية ، وخلايا المستقبلات الضوئية بين القطبين ، وتحقيق ذلك عن طريق استخدام شريط من نوع المناطق النشطة ، والتي تتيح سرعة عالية مستمرة والافراج عن العصبي على مدى فترات زمنية طويلة. ON - نوع من الخلايا المختلطة بين القطبين (MB) محطات ذهبية في الشبكية ، مما يزيل الاستقطاب للمؤثرات الضوء وتلقي قضيب المختلط وإدخال المخروط مبصرة ، هي مناسبة لدراسة الشريط من نوع المشابك على حد سواء نظرا لحجمها الكبير (10-12 ~ قطرها ميكرون) ، وعلاقاتهم عديدة متشابك الأطراف ومتبادلة مع التشعبات الخلية عديم الاستطالات. الوصول المباشر إلى محطات ميغابايت القطبين في الخلية شرائح ذهبية الشبكية مع تقنية التصحيح ، المشبك يسمح قياس الكالسيوم قبل المشبكي 2 + التيارات والتغيرات السعة الغشاء ، وردود الفعل المتبادلة تثبيط متشابك بوساطة GABA <وأعرب الفرعي> مستقبلات GABA A و C على المحطات. قبل المشبكي قياسات السعة غشاء إيماس تسمح لأحد لدراسة اللدونة قصيرة الأجل لإطلاق ناقل عصبي مثير 14،15. بالإضافة ، يمكن أيضا اللدونة قصيرة الأجل وطويلة الأجل لإطلاق النواقل العصبية من الخلايا المثبطة يكون عديم الاستطالات التي حققت فيها تسجيلات لتثبيط ردود فعل متبادلة وصوله الى محطة ميجا 21. على مدى فترات قصيرة من الوقت (على سبيل المثال ~ 10 ق) ، وردود الفعل المتبادلة GABAergic تثبيط من خلايا عديمة المحوار يخضع إقران النبض الاكتئاب غابا عن طريق حويصلة استنفاد تجمع 11. وبالتالي يمكن لديناميات متشابك من رقائق في طبقة الشبكية ضفيري الداخلية للشبكية دراستها مباشرة.
تم إدخال تقنية شريحة الدماغ أكثر من 40 عاما لكنها ما زالت مفيدة جدا للتحقيق في الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية ، سواء على سوما خلية واحدة ، تغصن واحد أو محور عصبي ، ومicrocircuit مستوى متشابك 19. وغالبا ما تكون الأنسجة التي هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن لصقها مباشرة على غرفة تشريح مضمن الأولى في أجار (أو وضعها على ورقة فلتر) وشرائح ثم 20 ، 23 ، 18 ، 9. في هذا الفيديو ، ونحن توظيف تقنية آغار قبل التضمين باستخدام الشبكية ذهبية. وaxotomized بعض المحطات العملاقة في القطبين خلية لدينا شرائح للشبكية ذهبية (محوار قطع) خلال إجراء تشريح. وهذا يسمح لنا محطة واحدة لعزل العصب قبل المشبكي المدخلات ، وذلك لأن التسجيل من المحطات axotomized يستبعد إشارات من المقصورة ، سوما شجيري. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أيضا تسجيل خلايا سليمة من القطبين ميغابايت ، من خلال تسجيل من محطات ملحقة المحاور التي لم يتم خفض أثناء إجراء تشريح. عموما ، سوف تستخدم هذا البروتوكول التجريبي المساعدات في دراسات علم وظائف الأعضاء متشابك شبكية العين ، والتحليل الوظيفي المتناهية الصغر ، وانتقال متشابك في نقاط الاشتباك العصبي الشريط.
Protocol
1. الخارجية والداخلية لحلول
- يعد حل تشريح (الكالسيوم منخفض) من محلول المخزون 10x وإضافة MgCl 2 ، CaCl 2 ، ودال الجلوكوز يوميا. الحل النهائي 1X يتكون من (مم) : 119 بوكل كلوريد الصوديوم 2.5 ، و 3.2 MgCl 2 ، 0.25 CaCl 2 ، 12 مد الجلوكوز ، 0.2 L - حمض الأسكوربيك ، 12 HEPES. تعيين درجة الحموضة إلى 7.4 (مع هيدروكسيد الصوديوم) ، وضبط الأسمولية إلى 260 mOsm (باستخدام H 2 O و 10x حل الأسهم).
- تزن من 3 ٪ انخفاض في درجات الحرارة التبلور آغار (Agarose نوع السابع - A ، A0701 ، سيغما ؛ Rieke ، 2001) والاختلاط مع تشريح الحل. الحرارة التي تحتوي على الحل أجار في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة أو حتى يذوب تماما ، واحتضان للأجار في حمام الماء (30-33 درجة مئوية) لمنع تصلب السريع (هلام درجة حرارة التحول : 26 ± 2 درجة C).
- إعداد الحل تسجيل (الكالسيوم العادي) من محلول المخزون 10x وإضافة MgCl 2 ، CaCl 2 ، ودال الجلوكوز يوميا. الحل النهائي consis 1Xمن TS (مم) : 100 كلوريد الصوديوم ، و 2.5 بوكل ، 1 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 ، 0.2 L - حمض الاسكوربيك ، 2.5 CaCl 2 ، 12 D - الجلوكوز. بعد حل محتدما في 95 ٪ O CO 2 / 5 ٪ 2 (كربوجين) لمدة 5-10 دقائق ، تعيين درجة الحموضة إلى 7.4 (مع هيدروكسيد الصوديوم) ، وضبط الأسمولية إلى 260 mOsm (باستخدام H 2 O و 10x حل الأسهم).
- مستعدون Aliquots (1 مل لكل منهما) من الحلول الداخلية ماصة مسبقا وحفظها في الثلاجة (-20 درجة مئوية). وعادة ما تستخدم حلول اثنين ماصة الداخلية لعزل التيارات القطبين الكالسيوم الخلية (مم) :
- CSCL 40 ، 60 CS - غلوكونات ، 10 رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA) ، CL ، HEPES 28 ، 3 MG - ATP ، 1 نا GTP ، وEGTA 2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 (مع CsOH) والأسمولية لتعيين 250 mOsm. هذا الحل يوفر كلوريد عالية الداخلية عادة أقل تسجيلات المقاومة سلسلة (أفضل الظروف المشبك الجهد) وأكبر التيارات بعد المشبكي المثبط (IPSCs) في القطبين غشاء الخلية المحتملة يستريح -60 بالسيارات.
- 95 CS - غلوكونات ، 10 TEA - CL ، 25 HEPES ، 3 MG - ATP ، 0.5 - GTP نا ، وEGTA 0.5. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 (مع CsOH) ، وتعيين الأسمولية إلى 250 mOsm 22. هذا المنخفض حل داخلي EGTA يؤدي عادة إلى ارتفاع السعة التغييرات التي تسببها غشاء depolarizing البقول ويسمح بالتالي خطوة دراسات استنفاد تجمع حويصلة والاكتئاب على المدى القصير.
2. أقطاب ماصة التصحيح ، المشبك
- إعداد سميكة الجدران (1.5 مم الخارجي) البورسليكات الزجاج (1B150F - 4 ؛ آلات دقيقة العالمية ، ساراسوتا ، فلوريدا) وسحب ماصات التصحيح باستخدام مجتذب العمودي (Narishige ، PP830 ؛ طوكيو ، اليابان). المقاومات ماصة مفتوح غيض التصحيح في تقديم حلول تسجيل وMΩ 7-8 عندما يتم تعبئة ماصة بمحلول ماصة الداخلية رقم 1.
- معطف التصحيح ماصة ، بالتساوي ، من طرف إلى مستوى العمود الذي يصل صاحب ماصة ، بالشمع الأسنان (Cavex ، غرب تشيستر ، والسلطة الفلسطينية). وهذا التقليل من السعة ماصة والضوضاء الكهربائية وتمكينأكثر دقة ، وانخفاض الضوضاء قياسات السعة. والسعة ماصة منخفضة يساعد أيضا على التعويض الإلكترونية C - السريعة (سريع السعة) من EPC - 9 (أو EPC - 10) التصحيح مكبر للصوت المشبك.
3. إعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية
- اختيار سمكة ذهبية (Carassius auratus ؛ 8-16 سم) ومكان في دلو مغطاة في غرفة مظلمة لمدة 30 دقيقة من التكيف مع الظلام. بعد التخدير ، والموت ببطء ذهبية مخدرا بواسطة قطع الرأس سريعة ومزدوجة بخع من الحبل الشوكي وجذع الدماغ. ثم إزالة العينين مع منحني معلومات سرية المقص والملقط منحني معلومات سرية. وقد تمت الموافقة على هذه الإجراءات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم (IACUC) في جامعة اوريجون للصحة والعلوم.
- Hemisect كل عين عن طريق خفض بالتساوي حول الجزء الأمامي من العين مع مقص الربيع (15003-08 ، أدوات العلوم الجميلة ؛ بدء بتخفيض ثقب مع نصائح المقص) ، ووضع eyecups في حل شريحة المبردة (الكالسيوم منخفض). إذا necessary ، إزالة عدسة مع ملاقط (عدسة سيتم فصل عادة مع الجزء الأمامي من العين). إزالة الشبكية مع الظهارة الصبغية التي تعلقها به زوجا من 45 درجة ملقط غيض الزاوية الدقيقة (11251-35 ، أدوات العلوم الجميلة) لشبكية العين قشر بعيدا عن فنجان العين ، تتقدم ببطء حول 360 درجة كاملة. قطع أو قطع العصب البصري إما مع غرامة ملقط أو مقص الربيع. إزالة شبكية العين بلطف مع مزيج من الزاوية ملقط غيض الجميلة والتطبيقية من شفط ماصة باستير تعديل أو نقل ماصة (نصيحة كبيرة). استخدام ملقط الزاوية غيض غرامة لإزالة ما تبقى من الظهارة الصبغية التي تعلق على شبكية العين. وينبغي على سطح الشبكية تنظيفها وصحية تظهر مظلمة ، على نحو سلس وحمراء اللون. لإزالة كاملة لجميع خلايا الظهارة الصبغية الظلام الداكن تكييف شبكية العين لمدة 1 ساعة (8 ، 1992).
- علاج شبكية العين معزولة مع 0.03 ٪ (وزن / المجلد ؛ ~ 0.36 ملغ / مل في حل شريحة 1X) ~ هيالورونيداز (3 ؛ H6254 ، سيغما) ل15-30 دقيقة في الغرفةدرجة الحرارة (20-23 درجة مئوية) لإزالة النكتة الزجاجي. خلال هذه الحضانة ، يمكنك تحضير الثلج الباردة حل شريحة.
- قطع قطعة مستطيلة من شبكية العين (~ مم 2X2 ، التي تحتوي على سمك الكامل لالشبكية) عن طريق إزالة الحواف المنحنية مع قطعة صغيرة من شفرة حلاقة (Personna ، ذو حدين ، وتنظيفها مع الايثانول 70 ٪ و H 2 O) الملحق جسد حقنة بلاستيكية 1 مل ، ونقل قطعة شبكية صغيرة إلى حاوية مليئة حل آغار (المعد في (1.2)). في محاولة لتقليل كمية من محلول حول شبكية العين كما هو وضعها في آغار السائل. تزج مباشرة في حل شريحة الثلج الباردة (المعد في (3.3)) لترسيخ آغار 20 ، 18 ، 9. نستخدم الصغيرة والحاويات المصنوعة يدويا. باختصار ، كانت قطع صغيرة ، أنبوب اسطواني (Fisherbrand ، قوارير البولي إثيلين عينة 2.5 مل ، 03-338 - 1B) في كلا طرفي ومختومة مع Parafilm (PM - 996 ، بيشيني بلاستيك التغليف) بقع.
- خفض كتلة صلبة آغار الى 1x1x1 سم مكعب يحتوي على قطعة مستطيلة من شبكية العين.
- نقل كتلة إلى غرفة شريحة والغراء على سطح لوحة التقطيع. هي الغرفة قبل شريحة وتبريد في الثلاجة (-20 درجة مئوية). خفض كتلة إلى شرائح سميكة 200-250 ميكرون باستخدام تقطيع Vibratome (VT1000S أو 1200S VT ، لايكا) في الجليد الباردة حل شريحة. ويمكن الحصول على ما مجموعه 5 to10 شرائح ، والتي هي قابلة للاستمرار لساعات 5-6 تقريبا.
- نقل واحدة من الشرائح إلى غرفة تسجيل. وضع شبكة من خيوط النايلون لاصق إلى إطار البلاتين على شكل U - 19 على أعلى شريحة ، ويروي باستمرار (معدل 1-2 مل في الدقيقة الواحدة) مع تسجيل فقاعات حل مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 (كربوجين ).
متاعب التصوير :
إذا تم فصل قطعة الشبكية جزءا لا يتجزأ من كتلة أجار أو يخرج من خلال تشريح آغار ، يمكن للمرء أن زيادة سمك شريحة من 200 ميكرون حتى 300 ميكرون في الزيادات من 20 ميكرون. أيضا في محاولة لتقليل كمية من محلول حول شبكية العين كما هو نقله ووضعه في آغار السائلة بنسبة امتصاص حل اضافي مع طرف تدحرجت "Kimwipe" ورقة. طريقة أخرى لتجنب هذه المشكلة للحد من حجم قطعة الشبكية وضعت في البداية في آغار. لأن النكتة الزجاجي يحظر آغار من الالتصاق التام للقطعة شبكية العين ، قد يكون من الضروري لجعل هيالورونيداز طازجة أو ضبط الوقت الحضانة (الخطوة (3.3)).
4. تحديد محطة خلية القطبين متشابك في شريحة الشبكية
- موقف شريحة الشبكية تحت المجهر تستقيم (مثل BX51WI ، أوليمبوس). ونحن نرى أن شريحة الشبكية مع الأشعة تحت الحمراء البصريات التدخل التفاضلية (IR - DIC) على النقيض من خلال الهدف الغمر بالمياه 60x (NA 0.90 ، أوليمبوس) ، واتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا (XC - 75 ، سوني). يتم إرسال الإخراج للكاميرا CCD إلى وحدة تحكم الكاميرا (C2400 ، هاماماتسو) لتعزيز النقيض من التصور قبل سوني على التناظرية 13 "blacك ورصد الأبيض. هي التي شنت على المجهر مرحلة الترجمة XY ، ويتم وضعها في غرفة تسجيل على 14 مرحلة ثابتة.
- العثور على أي خلية سليمة وaxotomized القطبين (محوار قطع) والمحطات ، والتي يمكن تحديدها من خلال حجمها وشكلها ، والموقف في شريحة (الشكل 1). ويمكن أيضا محطات Axotomized سليمة ويمكن تمييزها من خلال دراسة لهم capacitative عابرة مرات تسوس الحالية (واحد مقابل يضمحل الأسي المزدوج الأسي ، على التوالي) ، والكالسيوم 2 + التيارات (الشكل 2 ، 12 ، 14 ، 15). وتقع محطات ميغابايت في الطبقة القريبة من معظم sublamina ب (ON - نوع الطبقة ، المتاخمة للطبقة الخلايا العقدية) في طبقة ضفيري الداخلية للشبكية ذهبية. محطات ميغابايت ، مع سطحها مملة ومظهر مسطح ، ويمكن تمييزها بسهولة من العقدة وsomas عديم الاستطالات المشردين ، والتي تظهر بين مشرق ومرحلة كروية. علاوة على ذلك ، تتناول حافة محطات ميغابايت مع ارتفاعكثافة الاتصالات متشابك ، ويظهر خشنة وغير منتظمة مقارنة مع الأسطح ، على نحو سلس ونظيف من خلايا العقدة عديم الاستطالات (الشكل 1A - C). Axotomized محطات جولة دائرية تظهر ميغابايت وبالقرب من (الشكل 1C) ، في حين تظهر محطات سليمة بيضاوي الشكل وتمدد ، وغالبا مع نهاية مقروص مشيرا تجاه الطبقة النووية الداخلية لشبكية العين (الشكل 1A ، ب).
- محطات التالفة أو غير صحية في كثير من الأحيان تبدو منتفخة وعرض العديد من الهياكل حبيبية صغيرة على السطح. قد يكون من الممكن الحصول على ختم GΩ على هذه المحطات ، ولكن من المرجح أن تمزق بعد وقت قصير من تفكك في. علامات أخرى من المحطات غير صحية تشمل مظهر أجوف ، وعلى النقيض و / أو سطوع مطابقة للشريحة المحيطة بها ، وأحيانا مكان على سطح الشريحة. فمن الممكن أن يسجل كلا من محطات صحية عميقة في شريحة (ميزة : الدوائر متشابك أكثر سليمة) ، وكذلك بالقرب من سطح شريحة (أدفantage : سرعة الوصول إلى الأدوية perfused في حل الخارجية ؛ الأسهل لختم).
5. التسجيلات الكهربية والكالسيوم 2 + التصوير
- استخدام المحاقن مع تلميح مرشح 0.2 ميكرون (Nalgene) ، وملء ماصة الزجاج مع التصحيح الحل الداخلي إلى مستوى 1-2 سم من الجزء الخلفي من ماصة. بعد إزالة فقاعات الهواء من طرف وتأمين ماصة في حامل ، وتطبيق الضغط الايجابي (1،2-1،6 رطل) ، وتحريكه في اتجاه المحطة المستهدفة باستخدام micromanipulator (MPC - 200 ، آلات سوتر). في الوقت الذي يتجه نحو الانخفاض غيض من خلال شريحة ، ماصة نقل في اتجاه تجتاح الوحشي لضمان عدم سحب شريحة جنبا إلى جنب مع معلومات سرية.
- تحرك غيض ماصة حول محطة لتنظيف سطح الغشاء. دفع الطرف الهابط على حافة المحطة لإنشاء رصعة (البادئة) ، والافراج عن الضغط الايجابي. إذا ختم GΩ لا تشكل على الفور ، وتطبيق ضغط سلبي طفيف. بعد ختم GΩ ، التبديل إلى وضع التسجيل على خلية من مكبر للصوت المشبك EPC - 9 التصحيح والتغيير احتمال عقد ل-60 -70 أو بالسيارات. تطبيق C - السريعة (سريع السعة) التصحيح ، انتظر ختم لتحقيق الاستقرار بين GΩ 50-10 ، ثم تمزق الغشاء مع الشفط وحاد عن طريق الفم لطيف تطبيقها لتحديد تكوين تسجيل كامل الخلية. إذا تم تكوين خلية كاملة المنشأة بشكل صحيح ، وسوف يكون بين المقاومة سلسلة MΩ 14-30. وسوف تكون المقاومة الإدخال 200-500 MΩ لمحطات سليمة وGΩ 1-3 محطات axotomized 14.
- مراقبة عابرة بالسعة الحالية (الشكل 2a و 2C) ، للتمييز بين سليمة وaxotomized محطات خلية ثنائي القطب. محطات ميغابايت axotomized سليمة ولها غشاء السعة الأساسية من الجبهة الوطنية والجبهة الوطنية 9-16 3-8 ، على التوالي.
- تسري مدة 200 مللي الجهد المشبك الخطوة من -70 إلى 0 فولت إلى محطة axotomized ميغابايت. هذا سيسمحالقياس المباشر للكبير (~ 200-600 السلطة الفلسطينية) ، معزولة الداخل كا 2 + قنوات + التيارات تفعيلها من خلال افتتاح كا L - الجهد التي تعتمد على نوع 2 (الشكل 2B). في موازاة ذلك ، هو واحد قادرة على رصد القفزة السعة التي سببتها إيماس من الحويصلات المشبكية ، والسريع ، ودرجة الحموضة بوساطة تثبيط كا 2 + الحالي الذي يتبع إيماس 15 ، وردود الفعل المتبادلة GABAergic تثبيط (الشكل 3C ، 22). وإذا كان أحد بقع an خلية سليمة بين القطبين ميغابايت محطة تكون النتيجة كما هو موضح في الشكل 2C و 2D. لا يمكن تمييزه كا 2 + لوحظ التيارات بسبب التيارات الكبيرة "تسرب" بسبب الفجوة - مفترق اقتران التشعبات في الخلايا القطبين 1 ميغا بايت.
- يمكن أثار التغيرات السعة غشاء من الاستقطاب خطوة من المحتمل عقد -70 بالسيارات إلى 0 بالسيارات باستخدام "شرط + DC" طريقة حل وقت السعة غشاء القياسات 6. يقفز السعة غشاء تشير إلى اندماج الحويصلات متشابك مع غشاء البلازما. وأضيف 2 كيلو هرتز الجيبية الجهد المشبك الأمر (30 بالسيارات الذروة إلى الذروة) إلى إمكانية عقد -70 بالسيارات. وتم تحليل الحالي للتسجيل في زاويتين من المرحلة متعامد - 9 - EPC التصحيح المشبك مضاهاة مكبر للصوت للتأمين البرمجيات في مكبر للصوت (HEKA ، Lambrecht ، ألمانيا). في محطة سليمة من 2D الشكل ، ذات تردد عال (2 كيلو هرتز) حدود التحفيز الجيبية السعة الغشاء الذي يتم تحليله إلى النهايات الطرفية والمحور ، والتي لها سم السعة الأساسية ~ 6.8 PF. وهكذا يتم تصفية الغشاء من خلايا الجسم ، والتشعبات من الخلية القطبين من قبل ارتفاع وتيرة الجهد المشبك sinewave 13.
- كا 2 + لتصوير التجارب ، مزيج دقيق ماصة التصحيح الداخلية حل مع كا 2 + حساسة صبغة الفلورسنت (مثل ولاية أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 (100-200 ميكرومتر ؛ O - 6806 ، Invitrogen)) ، وكرر هذا البروتوكول من 50،1-5،5. هذا سوف يسمح لواحد من الجمع بين التصوير وتسجيل مضان الكهربية. على سبيل المثال ، فمن الممكن للصورة كا 2 + عابرة المرتبطة خطوة مللي من 200 إلى 0 -70 بالسيارات في الزوائد تغصنات انتهائية صغيرة من محطة ميغا بايت (الشكل 3A ، ب). قمنا بدمج المجهر لدينا أوليمبوس تستقيم مع قرص ليزر متحد البؤر المجهر الغزل نظام (CSU - X1 ، يوكوجاوا). يستخدم المجهر مبائر 488 نانومتر و 561 نانومتر خطوط الليزر التي يتم منظم من قبل عامل تصفية صوتية البصرية الانضباطي. يتم الحصول على البيانات باستخدام Slidebook البرمجيات (3I ؛ آلات التصوير الذكي). لمزيد من التفاصيل حول تقنيات التصوير الكالسيوم باستخدام الخلايا العصبية للشبكية انظر 24 ذهبية ، 17 ، 3.
متاعب التصوير :
إذا كان واحد فشل في كثير من الأحيان إلى إنشاء تكوين خلية كاملة ، حتى بعد تشكيل ختم GΩ مستقرة ، قد يكون من المفيد للحد من الضغط السلبي تستخدم لثقب محطة ليmbrane. قد يكون الحال أيضا أن أمثل ضغط السحب لإنشاء خلية كاملة التكوين يختلف بوصفها وظيفة من انحناء الغشاء (سوما> النهائي). ومن الممكن أيضا لاستخدام بروتوكول انطلق (السعة : 400 فولت ، المدة : 100 ميكروثانية) للدخول في تكوين خلية كاملة ، إما بمفرده أو بالاشتراك مع نبض حاد في الضغط السلبي. لقد تم العثور على بروتوكول انطلق لتكون مفيدة بشكل خاص لكسر في تلميح عند استخدام ماصة مع المقاومة في حمام تتجاوز 12 MΩ.
6. ممثل النتائج
الشكل 1. تحديد محطات ميغابايت القطبين في الخلية شرائح ذهبية في شبكية العين. (ميلان) IR - مدينة دبي للإنترنت صورا لمحطات ميغابايت خلية ثنائي القطب. يمكننا تحديد المحطات axotomized على الأرجح (محوار قطع) وسليمة في الصورة IR - مدينة دبي للإنترنت. محطة للaxotomized يظهر المستديرة والتعميم ، كما هو موضح في جفي حين أن محطة سليمة هو أكثر من المحتمل أن يظهر بيضاوي الشكل ، كما هو مبين في وب. ويمكن تأكيد هذا التصنيف عن طريق قياس سعة عابرة (انظر الشكل 2) أو من خلال طريقة صبغ التعبئة (د -- و). وأشار السهام الحمراء مكان تقاطع بين محور عصبي محور عصبي ومحطة لمحطات سليمة في وب. وأشار خط منقط أحمر كفاف من المحطات ميغابايت خلية ثنائي القطب. (مدافع). مضان صور محطات ميغابايت خلية القطبين مع محور عصبي سليمة (د) ، ومحور عصبي قطع جزئيا (ه) ، أو إزالة محوار بالكامل (و). وقد شغل اليكسا 555 (A20501MP ، Invitrogen) صبغة الفلورسنت مع حل داخلي قبل التسجيل. مباشرة بعد تسجيل التصحيح ، المشبك ، نقلت شريحة الشبكية إلى 4 ٪ (وزن / المجلد) بارافورمالدهيد (P6148 ، سيغما) في حل العازلة الفوسفات (70013 ، GIBCO) وحضنت لمدة 30دقيقة. وقد شنت شرائح على الشرائح Superfrost (فيشر العلمية) في المتوسط المائي المتصاعد مع وكلاء المضادة للتلاشي (Biomeda كورب). واعتبرت خلية تحتوي على اليكسا 555 ميغابايت مع القطبين محطات خط ليزر 555 نانومتر (أحمر) باستخدام الغمر بالماء 40X الهدف على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر (LSM 710 ، كارل زايس). لاحظ وجود الزوائد تغصنات انتهائية صغير يبرز من المحطات محوار (الأسهم الزرقاء). شريط النطاق تشير 10 ميكرومتر (أ -- و). INL : الطبقة النووية الداخلية ، IPL : ضفيري طبقة الداخلية ، GCL : خلية العقدة طبقة.
الشكل 2. الخصائص الكهربائية للمحطات axotomized وسليمة ميغابايت خلية ثنائي القطب. (أ ، ج) الاستجابة الراهنة عابر تفعيلها من خلال فرط الاستقطاب خطوة الجهد المشبك من المحتمل عقد ل-70 -60 بالسيارات بالسيارات. استجابة قصيرة الحالي إلى الخطوة -10 الجهد المشبك بالسياراتيمكن أن يؤدي إلى : 1) سريع الاضمحلال الأسي واحد مع المقاومة الحالية في مدخلات عالية -70 بالسيارات (مؤشرا على محطة axotomized ؛ فريق أ) ، أو 2) والاضمحلال الأسي المزدوج مع المقاومة مدخلات منخفضة في بالسيارات -70 (الإشارية محطة للسليمة ؛ ج اللوحة ، وانظر أيضا 12 ، 14 ، 15). (ب ، د) والكالسيوم 2 + أثار التيارات ويقفز السعة غشاء من الاستقطاب خطوة من -70 إلى 0 فولت. الوقت حل قياسات السعة غشاء استخدام التحفيز 2 كيلو هرتز sinewave فرضه على إمكانية عقد يستريح -70 6 بالسيارات. تتبع الأحمر هو متوسط قيمة من السعة نقاط البيانات. علما بأن القفزة في السعة والشكل 2B 2D كلاهما يساوي حوالي 200 فرنك فرنسي.
الشكل 3. قياسات مباشرة من الكالسيوم 2 + إشارات التصوير ، إيماس ، وردود الفعل في المثبطة Mب محطة القطبين الخلية. (أ) ارتفاع عابر في كا 2 + تم تنشيط التركيز في تغصنات انتهائية من محطة ميغابايت من الاستقطاب خطوة الجهد المشبك من -70 إلى 0 بالسيارات لمدة 200 مللي ثانية (السهم). وقد أدرجت ولاية أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 (100 ميكرون) ، والكالسيوم 2 + مؤشر صباغة ، في ماصة التصحيح. (ب) صورة مضان الموافق للتغصنات انتهائية ميغابايت (منطقة الاهتمام الذي أبدته الخط المنقط باللون الأحمر). (ج) على المدى القصير الاكتئاب متشابك الافراج العصبي (إيماس). 2 + تيارات كاليفورنيا (وسط التتبع) والأغشية السعة (أقل التتبع) التي حركها زوج من depolarizations مللي 20-0 بالسيارات (تتبع العلوي و 200 مللي الفاصل الزمني بين نبضة). السهم يشير إلى تأثير البروتونات exocytosed على الكالسيوم 2 + الحالية ، وكذلك ردود فعل متبادلة GABAergic تثبيط من الخلايا المجاورة عديم الاستطالات 15 و 21. علما بأن تثبيط البروتون بوساطة من الكالسيوم 2 + الحالية ، وكذلك في الديوانAergic تثبيط ردود فعل متبادلة موجودة فقط في أول رد depolarizing ، التي لديها أيضا قفزة السعة بسبب إيماس من الحويصلات المشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وثمة خطوة حاسمة وصعبة في بروتوكول لدينا هو نقل قطعة من شبكية العين في حل آغار (بروتوكول 3.4). فمن الضروري إزالة بعناية والفكاهة الزجاجي حل شريحة المتبقية من قطعة الشبكية ونقلها دون تحريف أو الانحناء. من أجل تحقيق هذا الهدف ، ونحن نستخدم ملعقة صغيرة (21 - 401 - 25B ، Fisherbrand) مع الطرف عازمة على تشكيل زاوية 90 درجة ، مع ملقط غيض الزاوية (11251-35 ، أدوات العلوم الجميلة) ، لوضع شبكية العين قطعة خلال عملية نقل في حل شريحة. يمكن إزالة بقايا حل شريحة على شريحة الشبكية وملعقة دقيق بواسطة اللمس من السطح مع زاوية Kimwipes مطوية أو تدحرجت (كيمبرلي كلارك).
طريقة أخرى شائعة لإعداد شرائح عرضية شبكية العين هو بروتوكول تصفية الورقية 23. باختصار ، هو تعلق قطعة المقلوب للشبكية كاملة لقطعة مستطيلة من القرص تصفية ميليبور (خلية العقدة تكمنإيه ضد ورقة الترشيح ، مبصرة مواجهة طبقة) ومقطعة إلى شرائح سميكة 250 ميكرون مع "الإبهام" دليل العمودي تقطيع اللحم (على سبيل المثال Narishige ST - 20). نجد أن مزايا بروتوكول الورقية تصفية تشمل صحة مبصرات ونسبة زيادة قدرها axotomized لمحطات ميغابايت سليمة. ونحن بالتالي استخدام هذا الأسلوب ورقة مرشح لانتزاع ردود الخفيف أثارت ميغابايت واحد من المحطات جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية.
مزايا بروتوكول آغار مقرها لدينا عبر بروتوكول الورقية التصفية هي أن 1) شريحة الشبكية المنتجة مسطح ، حتى ، ودون ضرر نسبيا مع فصل واضح بين الطبقات الشبكية ، والتي تمكن التصحيح في أي طبقة داخلية أو النووية ضفيري طبقة الشبكية الخلية التي هو المطلوب ، و 2) يتم تنفيذ المناعية تسجيل الكهربية التالية أكثر سهولة نظرا للهندسة سليمة وثابتة للشريحة والعوامل المذكورة في البند (1) أعلاه. بروتوكول لتسجيل استجابة الضوءتنطبق ق من الخلايا العصبية للشبكية في إعداد أجار مقرها في 2 إن الرب. تم أيضا إعداد شريحة أفقية الشبكية التي تستخدم مزيجا من أجار وتقنيات ورقة نشرت سابقا في تصفية 5 إن الرب. نوصي مشاهدة أشرطة الفيديو هذه في تركيبة مع منطقتنا للمقارنة بين تقنيات مختلفة.
الوصول المباشر إلى الشريط من نوع محطات قبل المشبكي في شبكية الفقاريات شرائح تتيح لنا تحقيق انتقال متشابك في مناطق الشريط من النوع النشط. كما يسمح لنا مباشرة لدراسة علم وظائف الأعضاء في رقائق متشابك في شبكية العين. وسوف تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتسجيلات إقران اشارات قبل وبعد متشابك ، بعد المشبكي مع الشركاء بما في ذلك الخلايا المثبطة عديم الاستطالات والخلايا التشويك العقدة 1 ، 16 ، 10. في الشريط تسجيلات إقران نوع نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا قوقعة الفئران الشعر الداخلي والتشعبات وارد وممكن ، ولقد وصفت بنسبة 7. الكالسيوم imagiوقد أجريت نانوغرام من الخلية محطات ميغابايت القطبين في الخلايا بشكل حاد في فصل 8 و 17 شرائح الشبكية ، وكذلك في الخلايا ذهبية عديم الاستطالات 3. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا لتحسينات كبيرة في الجسم الحي في النهج وoptogenetic المختبر في شبكية العين 4 الزرد المعدلة وراثيا. التوجهات المستقبلية سوف تنطوي على احتمال هذه التقنيات المعدلة وراثيا ، جنبا إلى جنب مع أساليب الكهربية ، والتي سوف تسمح لنا جسر الفجوة بين شريحة في تسجيلات المختبر والمجراة في التصوير ، مما يؤدي في النهاية إلى الدراسات السلوكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا مصالح متنافسة في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر الدكتور فريد Rieke لتفسير الرقيقة للأجار جزءا لا يتجزأ من إعداد شريحة الشبكية عندما بدأنا باستخدام بروتوكول في مختبرنا. كما نشكر لوري Vaskalis لتوضيح نظرة تخطيطية والدكاترة. Veeramuthu بالاكريشنان وتشو Soyoun للحصول على تعليقات مفيدة حول النص والفيديو. وأيد هذا العمل عن طريق منحة RO1 NEI - NIH ، وكان أيضا دعما جزئيا من خلال منحة مؤسسة كوريا للبحوث التي تمولها الحكومة الكورية [KRF - 2008 - 357 - E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
