Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo C. elegans Usando o corante vermelho fluorescente lipofílico DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que é comumente usado em C. elegans Para visualizar os neurônios expostos ambientalmente. Com este protocolo otimizado, asa e anular estruturas cuticulares estão manchadas pelo DII e observados através de microscopia composto.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cutícula do C. elegans é uma estrutura altamente resistente que envolve o exterior do 1-4 animal. A cutícula não só protege o animal do meio ambiente, mas também determina a forma do corpo e desempenha um papel na motilidade 4-6. Várias camadas secretadas por células epidérmicas compreendem a cutícula, incluindo uma camada lipídica externa 7.
Sulcos circunferenciais na cutícula chamados anéis padrão o comprimento do animal e estão presentes durante todas as fases de desenvolvimento 8. Asa são sulcos longitudinais, que estão presentes durante fases específicas de desenvolvimento, incluindo L1, Dauer e estágios adultos 2,9. Mutações em genes que afetam a organização do colágeno cuticular pode alterar a estrutura cuticular e morfologia do corpo de animais 5,6,10,11. Enquanto imagem cuticular usando microscopia óptica composto com DIC é possível, os métodos atuais que destacam estruturas cuticulares incluem fluorescentecento expressão do transgene 12, coloração de anticorpos 13, e microscopia eletrônica de 1. Rotulados aglutinina de gérmen de trigo (WGA) também tem sido usado para visualizar glicoproteínas cuticular, mas é limitada na resolução de estruturas mais finas cuticular 14. Coloração da superfície cuticular usando corante fluorescente tem sido observado, mas nunca caracterizados em detalhe 15. Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo C. elegans utilizando o corante vermelho fluorescente lipofílico DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que é comumente usado em C. elegans para visualizar os neurônios expostos ambientalmente. Este protocolo otimizado para a coloração de DII é um método simples e robusta para a visualização de alta resolução fluorescentes de anéis, asa, vulva, da cauda dos machos, e cauda hermafrodita pico de C. elegans.
Protocolo
1. Preparação de DII mancha
- Prepare uma solução estoque de 20 mg / mL DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) em DMF. DII é sensível à luz, de modo a proteger da luz DII por envolvimento em folha.
- Criar uma diluição de trabalho de DII, adicionando 0,6 mL de ações DII para 399,4 M9 mL para cada população. Isso deve dar uma diluição final de trabalho de 30 mcg / mL em DII M9. Isto pode ser ampliada para a coloração de múltiplas populações simultaneamente. DII escudo da luz envolvendo o tubo (s) em folha.
2. Preparação de nematóides
- Use uma placa de 60 milímetros contendo uma população de nematóides não contaminada. Lavar os animais de placa usando uma solução de 0,5% Triton X-100 em tampão M9 rodando suavemente líquido em um movimento circular em toda a superfície da placa para soltar todos os animais de larva e adulto. Transferência de lavar em um tubo estéril 1,5 mL.
- Imediatamente girar os animais a 2000 rpm por 30 segundos. Remova e descarte o máximo supernatant possível sem perturbar a massa de animais no fundo do tubo.
- Para reduzir residual Triton X-100, lavar os animais usando M9 buffer, spin, e remover o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
- Adicionar 400 mL de solução de trabalho DII em M9 para o tubo e agitar brevemente em vórtice para ressuspender animais na solução.
- Agite tubo a 20 ° C na horizontal durante 3 horas a 350 rpm em um ambiente de luz protegida. Se desejado, os animais podem ser incubadas até 16 horas para a coloração.
- Para reduzir a quantidade de tintura não acoplado, girar os animais a 2000 rpm por 20 seg. Remova e descarte o máximo possível sobrenadante sem perturbar a massa de animais.
- Animais ressuspender em 400 mL de buffer M9 e derramar líquido sobre uma parte livre de bactérias de uma placa de agar NGM semeados com OP50 E. coli. Permitir que os animais para recuperar pelo menos 30 minutos. Durante o tempo de recuperação dos animais deve arrastar para longe o líquido coloração DII e para a comida. Este passoreduz a fluorescência de fundo de DII livre.
3. Montagem e observação de espécimes
- Melt agar 4% em água usando um autoclave ou forno de microondas.
- Criar espaçadores reutilizáveis, que podem ser usados para garantir a espessura uniforme da almofada agar, por camadas dois pedaços de fita laboratório em uma lâmina de vidro. Faça dois slides espaçador total.
- Organizar uma lâmina de vidro limpa entre dois slides espaçador. Pipetar cerca de 150 mL (quatro gotas) de 4% agar derretido para o centro da lâmina de vidro limpa. Rapidamente cobrir o ágar fundido usando um slide adicional para formar um bloco de agar. Remova cuidadosamente a cobertura deslizante, mantendo o bloco centrado na parte superior do slide de montagem.
- Pipetar cerca de 5 mL de nematóide anestésico (100 M - 1 levamisole mM, por exemplo) sobre a almofada.
- Monte 8-12 animais no anestésico e cobrir com uma lamela de microscópio.
- Observe os animais utilizando um microscópio composto ou confocal equipados com pelo menos uma objetividade 40x ve e um DSRed / TRITC (ou outro compatível) do filtro. O máximo de excitação de fluorescência de DII é 549 nm e sua emissão máxima é 565 nm para corante ligado (Biotium, Inc., Hayward, CA).
4. Resultados representante
Manchas DII cutícula do C. do tipo selvagem e mutante elegans. A superfície cuticular contém anéis separados por sulcos circunferenciais e, em alguns estágios, sulcos longitudinais chamado asa. Cada estágio de desenvolvimento tem estruturas cuticulares com composições distintas 2. Sulcos ou sulcos de ambos asa e anéis fluorescente mancha, dependendo da composição da superfície, ao longo de fases de larva e adulto e permanecem visíveis até um dia após a recuperação usando esse método. Manchas fundo fluorescente são por vezes observados (Figuras 2F, G), mas não rotineiramente (Figura 1, Figura 2A-E, H, I). Todas as imagens foram tiradas com disco girando confocal ou, quando indicado, campo amplo de microscopia composto (wf).
ent ">
Figura 1. Manchas DII cutícula e neurônios expostos ambientalmente. L2 animais palco. Ampliação de 630x. Partes da imagem em mosaico foram capturados usando-iVision Mac software (BioVision Technologies, Exton, PA). As imagens foram unidas com Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Barra de escala = 10 mM. DII também fluorescente manchas amphid e phasmid neurônios sensoriais na cabeça e cauda, respectivamente (setas marcar alguns).
Figura 2. DII fluorescente manchas C. elegans cutícula em todas as fases de desenvolvimento pós-embrionário. Ampliação de 630x. Barra de escala = 10 mM. De coloração de tipo selvagem animais em A L1); B) L2; C) Dauer; D) L3; E) L4, e F) Ciclo de adultos. As cristas asa e anular são manchadas fluorescente nos animais L1 e Dauer (A, C). Manchas DII cristas anelares em animais L2(B). Sulcos anulares mancha em L3 e L4 animais (D, E). Os sulcos da asa e anéis estão manchadas em animais adultos (FH). Asa são compostas de dois, cinco, ou três cumes (em L1, Dauer, ou animais adultos, respectivamente) que correm o comprimento do animal (setas) 16. Anéis criar sulcos circunferenciais ao redor do animal (setas F e J). A cutícula de adultos animais mutantes mostrar moderada defeitos organização cuticular (GH). G) Cumes da asa são descontínuos (wf). H) cumes alae supranumerários são fundidos e ramificada ou bifurcada (wf). Mutantes do gene colágeno exibem asa e defeitos organização anular (IJ). I) Em animais transgênicos com superexpressão pRF4 (rol-6 (su1006)), cumes de mentira asa em um ângulo para o comprimento do animal. J) anéis em animais transgênicos com superexpressão pRF4 (rol-6 (su1006)) apresentam um padrão irregular.
Figura 3. Externestruturas morfológicas al são iluminados por coloração DII. ampliação 630x. Barra de escala = 10 mM. DII também destaca outras características exteriores, incluindo A) adulto hermafrodita vulva, B) adulto raios da cauda dos machos e fã, e C) hermafrodita cauda pico (bifurcada neste contexto mutante).
Cutícula Figura 4. Demora mais tempo a mancha com DII do que neurônios expostos ambientalmente. Ampliação de 630x. Barra de escala = 10 mM. Após duas horas de coloração, amphid (não mostrado) e phasmid neurônios sensoriais (setas) são suficientemente manchada. Em contraste, a cutícula dos animais mais jovens é apenas parcialmente corados em patches (seta).
| Lavar | Solução mancha (+ DII) | Tempo de incubação | Cutícula manchada |
| M9 + Tr 0,5%iton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 2 hrs | não |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 3 hrs | não |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 2 hrs | parcial |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 3 hrs | sim |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 2 hrs | parcial |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 3 hrs | sim |
Tabela 1. Coloração cuticulares em diferentes condições. Vários soluções de incubação e os tempos foram testados para otimizar a coloração cuticular em animais. H 2 0, água destilada estéril. Coloração parcial indica coloração irregular da cutícula larval (Figura 4), embora as manchas cutícula adulto consistently.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O método de coloração DII aqui apresentado permite uma forma relativamente rápida e conveniente de visualizar a cutícula em C. elegans. Pela redefinição e otimização de um método comumente usado para a imagem ambientalmente expostos neurônios sensoriais 15,17, DII pode ser usado para fluorescente mancha tanto asa e estruturas anulares (Figuras 1 e 2), bem como a vulva, a cauda do sexo masculino e hermafrodita cauda pico (Figura 3). Descobrimos que a solução de incubação ea influência do tempo a capac...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não temos nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, e HC. Hsiao para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por fundos start-up do Departamento TAMHSC de Medicina Molecular e Celular. O escopo composto e disco giratório foram comprados com fundos fornecidos pelo departamento eo Escritório TAMHSC do Dean. Algumas cepas foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos. pRF4 (rol-6 (su1006)) foi um presente de Fogo A..
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Reagentes | Sinônimos | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| DII | 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato | Biotium, Inc. | 60010 | Diluição Stock: 20 mg / mL em DMF diluição de trabalho: 30 mg / mL |
| DMF | Dimetilformamida | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Tritão X-100 | Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | KH 2 PO 4 22mm, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1mM MgSO 4 | |||
| NGM | Meio de crescimento de nematóides | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Podem ser preparados seguindo o protocolo NGM ágar 18 |
| Ágar-ágar | EMD Chemicals, Inc. | 1,01614 | 4% em água | |
| Levamisol | Cloridrato de levamisol | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 M - 1 levamisole mM, conforme exigido |
| Lâminas de microscópio | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Cobrir copos microscópio | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Âmbito composto | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objetivos para corresponder às necessidades do experimento | |
| TRITC ou outro filtro compatível | Chroma Technology Corp | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered conjunto de filtros |
Referências
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
