Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

Summary

Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo C. elegans Usando o corante vermelho fluorescente lipofílico DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que é comumente usado em C. elegans Para visualizar os neurônios expostos ambientalmente. Com este protocolo otimizado, asa e anular estruturas cuticulares estão manchadas pelo DII e observados através de microscopia composto.

Abstract

A cutícula do C. elegans é uma estrutura altamente resistente que envolve o exterior do ^1-4 animal. A cutícula não só protege o animal do meio ambiente, mas também determina a forma do corpo e desempenha um papel na motilidade ^4-6. Várias camadas secretadas por células epidérmicas compreendem a cutícula, incluindo uma camada lipídica externa ^7.

Sulcos circunferenciais na cutícula chamados anéis padrão o comprimento do animal e estão presentes durante todas as fases de desenvolvimento ^8. Asa são sulcos longitudinais, que estão presentes durante fases específicas de desenvolvimento, incluindo L1, Dauer e estágios adultos ^2,9. Mutações em genes que afetam a organização do colágeno cuticular pode alterar a estrutura cuticular e morfologia do corpo de animais ^5,6,10,11. Enquanto imagem cuticular usando microscopia óptica composto com DIC é possível, os métodos atuais que destacam estruturas cuticulares incluem fluorescentecento expressão do transgene ^12, coloração de anticorpos ^13, e microscopia eletrônica de ^1. Rotulados aglutinina de gérmen de trigo (WGA) também tem sido usado para visualizar glicoproteínas cuticular, mas é limitada na resolução de estruturas mais finas cuticular ^14. Coloração da superfície cuticular usando corante fluorescente tem sido observado, mas nunca caracterizados em detalhe ^15. Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo C. elegans utilizando o corante vermelho fluorescente lipofílico DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que é comumente usado em C. elegans para visualizar os neurônios expostos ambientalmente. Este protocolo otimizado para a coloração de DII é um método simples e robusta para a visualização de alta resolução fluorescentes de anéis, asa, vulva, da cauda dos machos, e cauda hermafrodita pico de C. elegans.

Protocol

1. Preparação de DII mancha

1. Prepare uma solução estoque de 20 mg / mL DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) em DMF. DII é sensível à luz, de modo a proteger da luz DII por envolvimento em folha.
2. Criar uma diluição de trabalho de DII, adicionando 0,6 mL de ações DII para 399,4 M9 mL para cada população. Isso deve dar uma diluição final de trabalho de 30 mcg / mL em DII M9. Isto pode ser ampliada para a coloração de múltiplas populações simultaneamente. DII escudo da luz envolvendo o tubo (s) em folha.

2. Preparação de nematóides

1. Use uma placa de 60 milímetros contendo uma população de nematóides não contami....

Discussion

O método de coloração DII aqui apresentado permite uma forma relativamente rápida e conveniente de visualizar a cutícula em C. elegans. Pela redefinição e otimização de um método comumente usado para a imagem ambientalmente expostos neurônios sensoriais ^15,17, DII pode ser usado para fluorescente mancha tanto asa e estruturas anulares (Figuras 1 e 2), bem como a vulva, a cauda do sexo masculino e hermafrodita cauda pico (Figura 3). Descobrimos que a solução de incubação ea influência do tempo a capac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes	Sinônimos	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DII	1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato	Biotium, Inc.	60010	Diluição Stock: 20 mg / mL em DMF diluição de trabalho: 30 mg / mL
DMF	Dimetilformamida	Sigma-Aldrich, Inc.	D4551
Tritão X-100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR International, LLC.	EM-9410
M9	KH 2 PO 4 22mm, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1mM MgSO 4
NGM	Meio de crescimento de nematóides	IPM Scientific, Inc.	11006-501	Podem ser preparados seguindo o protocolo NGM ágar 18
Ágar-ágar		EMD Chemicals, Inc.	1,01614	4% em água
Levamisol	Cloridrato de levamisol	Sigma-Aldrich, Inc.	31742	100 M - 1 levamisole mM, conforme exigido
Lâminas de microscópio		VWR International, LLC.	16005-106
Cobrir copos microscópio		VWR International, LLC.	16004-302
Âmbito composto		Carl Zeiss, Inc.	A1m	Use objetivos para corresponder às necessidades do experimento
TRITC ou outro filtro compatível		Chroma Technology Corp	49005	ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered conjunto de filtros