Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.
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Artigo de método
Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic
Neste artigo
Resumo
Resumo
Interneurônios locais são continuamente regeneradas no bulbo olfativo dos roedores adultos 1-3. Neste processo, chamado de neurogênese adulta, células-tronco neurais nas paredes do ventrículo lateral dão origem a neuroblastos que migram para vários milímetros ao longo do córrego migratório rostral (RMS) para alcançar e incorporar no bulbo olfatório. Para estudar as diferentes etapas e do impacto da educação de adultos-nascido integração neurônio em circuitos pré-existentes olfativa, é necessário para, seletivamente, rotular e manipular a atividade dessa população específica de neurônios. O desenvolvimento recente de tecnologias optogenetic oferece a oportunidade de usar a luz para ativar precisamente esta coorte específicos de neurônios, sem afetar os neurônios em torno de 4,5. Aqui, apresentamos uma série de procedimentos para virally expressar Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP em uma coorte temporalmente restrito de neuroblastos na RMS antes de chegar ao bulbo olfativo e tornar-se adulto-nascido neurons. Além disso, mostramos como implantar e calibrar uma miniatura LED para doenças crônicas na estimulação in vivo de ChR2-expressando neurônios.
Protocolo
1. Estereotáxica injeções
- O vírus usado nesses experimentos é um vetor de replicação-deficiente lentiviral com base no vírus HIV para expressar Channelrhodopsine2-YFP (proteína fluorescente amarela) fusão construção conduzido por um promotor sinapsina 6. O plasmídeo foi generosamente fornecidos pelo grupo de pesquisa K. Deisseroth 's ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentivírus podem ser obtidas de fontes comerciais ou produzidos no laboratório de acordo com protocolos estabelecidos 7. Vector títulos médios foram da ordem de 10<....
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Discussão
Ferramentas Optogenetic aumentaram recentemente o nosso controle sobre as populações neuronal seletiva, incluindo os neurônios adultos nascidos no sistema olfativo. Aqui nós descrevemos como executar uma injeção estereotáxica de um vetor lentiviral expressar ChR2-YFP em uma população específica de adultos-nascido neurônios. Através da monitorização cuidadosa do período pós-injeção, somos capazes de analisar e manipular a atividade de uma coorte de adultos-nascido neurônios com uma idade relativa homogênea.
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela empresa de seguros de vida "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurociências de Paris (PEV), a Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" no quadro de "NEURON ERA-NET" de FP7 programa pela Comissão Europeia, "Foundation pour la Recherche Medicale", a Fundação Letten ea Fundação Pasteur.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | Companhia | No. de catálogo | |
| Ketamina | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xilazina | Bayer Health Care | Rompum 0,2% | |
| Pipeta Puller | Sutter | P-97 | |
| Capilares de vidro (3,5 ") | Drummond Scientific | 3-000-203-G / X | |
| Nanoject II microinjetor | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Broca cirúrgica de alta velocidade | Multa Ferramentas Ciência | 18000-17 | |
| Broca Aço Micro Burrs diâmetro da ponta 0,7 milímetros | Multa Ferramentas Ciência | 19008-07 | |
| LED azul CMS 4,6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Conector elétrico do sexo feminino (2,54 mm) | Fischer Elektronik | BL5.36Z | |
| Controlador de corrente para LED (máx: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Gerador de pulso | Ampi | Mestre-8 | |
| Medidor de potência óptica | Thor Labs | PM100 | |
| Cianoacrilato | Loctite | 454 | |
| Cimento policarboxilato (primeira camada de cimento) | Septodont | Selfast (# 0068Q) | |
| Cimento de metacrilato (cimento segunda camada) | GC InternationalCorp. | Unifast Trad - Liquid (# 339292) Unifast Trad - Pó (# 339114) | |
| Carprofeno | Pfizer | Rimadyl |
Referências
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.....
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Reimpressões e permissões
