Artigo de método

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

DOI:

10.3791/3399

⸱

17 de novembro de 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demonstrará a extração e análise de ácidos graxos bioativos livres e esterificados das células. Os ácidos graxos são quantificados com precisão usando diluição de isótopos estáveis, cromatografia líquida quiral, espectrometria de massa de monitoramento de reações múltiplas de ionização química atmosférica de captura de elétrons (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O metabolismo de ácidos graxos, como ácido araquidônico (AA) e ácido linoléico (LA), resulta na formação de lipídios bioativos oxidados, incluindo numerosos estereoisômeros1,2. Esses metabólitos podem ser formados a partir de ácidos graxos livres ou esterificados. Muitos desses metabólitos oxidados têm atividade biológica e têm sido implicados em várias doenças, incluindo doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, asma e câncer3-7. Os lipídios bioativos oxidados podem ser formados enzimaticamente ou por espécies reativas de oxigênio (ROS). As enzimas que metabolizam ácidos graxos incluem ciclooxigenase (COX), lipoxigenase (LO) e citocromos P450 (CYPs)1,8. O metabolismo enzimático resulta na formação enantiosseletiva, enquanto a oxidação das ROS resulta na formação racêmica dos produtos.

Embora este protocolo se concentre principalmente na análise de metabólitos bioativos derivados de AA e alguns LA, ele pode ser facilmente aplicado a metabólitos de outros ácidos graxos. Os lipídios bioativos são extraídos do lisado celular ou do meio usando extração líquido-líquido (l-l). No início do processo de extração l-l, padrões internos de isótopos estáveis são adicionados para contabilizar erros durante a preparação da amostra. A diluição de isótopos estáveis (SID) também é responsável por quaisquer diferenças, como supressão de íons, que os metabólitos podem experimentar durante a análise de espectrometria de massa (MS)9. Após a extração, a derivatização com um reagente de captura de elétrons (EC), brometo de pentafluorilbenzila (PFB), é empregada para aumentar a sensibilidade de detecção10,11. O monitoramento de reações múltiplas (MRM) é usado para aumentar a seletividade da análise de MS. Antes da análise de MS, os lipídios são separados usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) quiral de fase normal. As condições de HPLC são otimizadas para separar os enantiômeros e vários estereoisômeros dos lipídios monitorados12. Este método específico de LC-MS monitora prostaglandinas (PGs), isoprostanos (isoPs), ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETEs), ácidos hidroxioctadecadienóicos (HODEs), ácidos oxoeicosatetraenóicos (oxoETEs) e ácidos oxooctadecadianóicos (oxoEDEs); no entanto, os parâmetros de HPLC e MS podem ser otimizados para incluir quaisquer metabólitos de ácidos graxos13.

A maioria dos métodos bioanalíticos atualmente disponíveis não leva em consideração a quantificação separada de enantiômeros. Isso é extremamente importante ao tentar deduzir se os metabólitos foram ou não formados enzimaticamente ou por ROS. Além disso, as proporções dos enantiômeros podem fornecer evidências de uma via enzimática específica de formação. O uso do SID permite a quantificação precisa dos metabólitos e é responsável por qualquer perda de amostra durante a preparação, bem como as diferenças experimentadas durante a ionização. O uso do reagente de captura de elétrons PFB aumenta a sensibilidade de detecção em duas ordens de magnitude em relação aos métodos convencionais de APCI. No geral, este método, SID-LC-EC-ionização química à pressão atmosférica APCI-MRM / MS, é um dos métodos mais sensíveis, seletivos e precisos de quantificação de lipídios bioativos.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Misturas Padrão e Padrão Interno

  1. Antes da extração de lipídios, deve-se preparar uma mistura padrão (SM) e uma mistura padrão interna (ISM). Para o SM, alíquota do volume equivalente de 1 μg de cada padrão (25 no total) listado no quadro de reagentes abaixo, utilizando uma seringa calibrada, para um balão volumétrico de 10 ml. Secar os padrões em azoto e reconstituir em 10 ml de acetonitrilo (ACN). A concentração final da mistura padrão será de 100 pg/μL. Divida em alíquotas de 1 mL e armazene a -80°C até que seja necessário.
  2. A partir desta mistura padrão, 6 diluições padrão podem ser feitas para um total de 7 padrões de calibração (1 pg/μL, 2 pg/μL, 5 pg/μL, 10 pg/μL, 20 pg/μL, 50 pg/μL e 100 pg/μL). Esses padrões devem ser executados com cada lote de amostras preparado para desenvolver a curva de calibração usada na análise quantitativa.
  3. Para o ISM, alíquota do volume equivalente de 1 μg de cada IS (14 no total) listado no quadro de reagentes abaixo para um balão volumétrico de 10 ml, utilizando uma seringa calibrada, e secar sob azoto. Reconstituir o MIS em 10 mL de NCA e dividir em alíquotas de 1 mL. A concentração final do ISM deve ser de 100 pg/μL. Há ISM suficiente para processar 1000 amostras.
  4. Armazene o SM e o ISM a -80°C.

2. Coleta de meios e lisado celular

  1. Para cada placa de 10 cm de células aderentes (~ 1 X 107), colete 3 mL de meio em um tubo centrífugo de vidro de 10 mL. Em seguida, lave as células 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicione 1 mL de PBS à placa e raspe as células da placa e pipete em um segundo tubo de centrífuga de vidro de 10 mL. Neste ponto, células e mídia podem ser armazenadas se o procedimento não for continuado neste momento. Armazene as amostras a -80 ° C para armazenamento de longo prazo ou a -20 ° C por menos de uma semana.

3. Extração de lipídios do meio

  1. Os lipídios bioativos livres são encontrados no meio celular e são facilmente extraídos com um procedimento de extração l-l de uma etapa. Ao meio coletado (2.1), adicione 10 μL de ISM. Neste momento, 8 tubos de centrífuga de vidro adicionais de 10 mL devem ser rotulados como #0-7 para os padrões de calibração. Adicione 3 mL de PBS a cada um desses tubos e, em seguida, adicione 10 μL do SM apropriado aos tubos 1-7 (1-7 de 1.1).
  2. Deixar o ISM equilibrar-se em cada padrão de calibração e amostrar durante 10 minutos e, em seguida, adicionar 5 ml de éter dietílico. As amostras e os padrões de calibração são então colocados no agitador em baixa velocidade por 30 minutos em temperatura ambiente.
  3. Após agitação, todos os padrões de calibração e amostras são centrifugados a 1935 x g por 10 minutos. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur, transferir a fase superior (orgânica) para um novo tubo de centrífuga de vidro de 10 mL e secar sob nitrogênio.

4. Extração de lipídios do lisado celular

  1. Gire as amostras de células nos tubos de centrífuga de vidro a 1935 X g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante; adicione 2 mL de PBS a cada tubo e vortex brevemente. Remova 25 μL de amostra para quantificação de proteínas. A proteína total será utilizada para normalização do lisado celular.
  2. Em seguida, transfira metade da mistura de lisado / PBS para um tubo de centrífuga de vidro separado de 10 mL. Adicione mais 2 mL de PBS junto com 10 μL de ISM a cada amostra. Seguir o processo de extracção l-l descrito para os meios em 3.2 e 3.3. Esta alíquota será usada para medir lipídios livres nas células e evitar a degradação alcalina de lipídios, como as prostaglandinas. Esta alíquota não passará pelas etapas 4.3 e 4.4 descritas abaixo.
  3. A primeira etapa do processo de extração lipídica esterificada l-l requer a adição de 5 mL de CHCl3/MeOH (2:1) a cada uma das amostras. As amostras são colocadas em um agitador em velocidade baixa por 30 minutos. Após agitação, as amostras são centrifugadas a 1935 x g por 10 minutos. Em seguida, usando uma pipeta de Pasteur, transfira a camada inferior (orgânica) da extração l-l para um novo tubo de centrífuga de vidro de 10 mL e seque a amostra sob nitrogênio.
  4. Os lipídios esterificados devem ser saponificados antes da quantificação. Quando as amostras estiverem secas, adicione 0,5 mL de KOH 0,4N em 80% MeOH a cada tubo. As amostras são então incubadas a 60°C por 1 h. Após a incubação, adicione 2 mL de PBS. Ajuste o pH para 6 com ácido HCl concentrado (~ 30 μL). Adicione 10 μL de ISM a cada amostra. O resto do procedimento é o mesmo que a extração de lipídios do meio e pode ser seguido em 3.2 e 3.3.
  5. Se estas extracções forem efectuadas simultaneamente com as amostras de meios, podem ser utilizados os mesmos padrões de calibração para desenvolver uma curva de calibração; no entanto, se estas amostras forem executadas noutro momento, os padrões de calibração devem também ser processados como descrito nos pontos 3.1-3.3.

5. Derivatização de pentafluorilbenzilbrometo (PFB)

  1. Às amostras secas e aos padrões de calibração, adicionar 100 μL de diclorometano anidro (CH2Cl2) seguido de 100 μL de 20% (v/v) de N,N-diisopropiletilamina em CH2Cl2 anidro e, finalmente, 100 μL de PFB a 20% (v/v) em CH2Cl2 anidro.
  2. Após a adição de reagentes de derivatização, as amostras são submetidas a vórtices, incubadas a 60°C por 1 h e secas sob nitrogênio. As amostras e os padrões de calibração podem ser armazenados a -80 ° C se não forem analisados imediatamente ou a -20 ° C por até uma semana.

6. Análise de Espectrometria de Massa de Ionização Química de Ionização de Pressão Atmosférica de Diluição de Isótopos Estáveis (SID-LC-ECAPCI-MS)

  1. As amostras secas e os padrões de calibração são reconstituídos em 100 μL de hexano/etanol (97:3). A amostra inteira pode então ser transferida para o frasco de HPLC com inserção. Coloque as amostras no amostrador automático refrigerado (4 °C) e crie uma lista de amostras para análise.
  2. Em seguida, configure os métodos HPLC e MS usando os parâmetros descritos na Tabela 1 e na Tabela 2 abaixo. A Tabela 3 contém informações específicas sobre compostos, incluindo a transição MRM e a energia de colisão (CE) para cada lipídio, bem como o tempo de retenção estimado da análise Waters 2695 / Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. O CE é determinado ajustando cada lipídio individual durante o desenvolvimento do método.
  3. Uma coluna Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) aquecida a 30°C é usada para a separação de fase normal. A fase móvel inicial é 98% hexano e 2% metanol/isopropanol (1:1). Após a separação por HPLC, o metanol é adicionado após a coluna (0,75 mL / min) para evitar a deposição na agulha Corona que causaria uma diminuição na sensibilidade. O MS é definido no modo de íons negativos usando a fonte APCI. Se a fonte precisar ser alterada de ESI para APCI, certifique-se de inserir uma agulha Corona.
  4. A primeira amostra que deve ser executada é sempre um branco hexano. Isso equilibrará a coluna e também revelará se há alguma contaminação na coluna que possa interferir no padrão de calibração e na análise da amostra.
  5. As próximas amostras executadas devem ser as amostras padrão de calibração na ordem de 0-7 (aumentando a concentração de SM). Esses padrões serão usados para criar uma curva de calibração contendo a razão entre a área padrão / área IS no eixo y e a concentração ou massa padrão no eixo x. A partir da equação y = mx + b derivada deste gráfico, a razão entre a área amostral / área IS (y) pode ser usada para determinar a quantidade ou concentração (x) da amostra (desconhecida).
  6. A quantidade de lipídios bioativos encontrados no meio pode ser normalizada para o volume total do meio e a quantidade de lipídios encontrados no lisado celular pode ser normalizada para o número total de células/placa ou a quantidade de proteína total/placa. Devem ser tomadas medidas durante o ponto 4.1 do protocolo para garantir que as células são contadas ou que a proteína é quantificada.

7. Resultados Representativos:

Os cromatogramas na Figura 1 são representativos de um perfil lipidômico direcionado. O primeiro painel (Figura 1A) mostra 13- e 9-HODE juntamente com os correspondentes 13- e 9-oxoODE, derivados do ácido linoléico. Além disso, 15-oxoETE, o metabólito oxidado de 15-HETE também é mostrado no segundo painel. Os dois painéis inferiores mostram 20-HETE e 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. A Figura 1B mostra a separação e as transições únicas determinadas para os estereoisômeros HETE que resultam da oxidação enzimática de AA ou por ROS. A Figura 1C é uma representação de PGs, isoPs e LTB4. Alguns dos padrões não têm um IS deuterado disponível comercialmente; portanto, um IS semelhante em tempo de retenção é usado para quantificação. Por exemplo, [2H8]-12(S)-HETE é usado para quantificar as espécies 11-HETE e 8-HETE, além de 12(R)-HETE e 12(S)-HETE.

A partir dos cromatogramas representativos, é evidente que há uma pequena mudança na retenção do IS deuterado em comparação com o padrão não marcado. Essa mudança para um tempo de retenção posterior é resultado da interação do deutério com a coluna de fase normal. O deutério é mais polar que o hidrogênio; portanto, há uma interação mais forte com a fase normal da coluna. Se essa separação estivesse ocorrendo usando uma coluna de fase invertida, a mudança seria para um tempo de retenção anterior, pois uma porção mais polar teria uma interação mais fraca com a fase reversa.

figure-protocol-1
Figura 1. Esta figura é um exemplo representativo de uma análise lipidômica direcionada. A Figura 1A mostra os cromatogramas de íons totais (TIC) para vários metabólitos oxidados LA e AA, incluindo 13-oxoODE e 9-oxoODE no primeiro painel, 15-oxoETE no segundo painel, 13-HODE e 9-HODE (painéis 3 e 5) e 20-HETE (painel 7). Os HODEs e 20-HETE têm um IS deuterado correspondente no painel abaixo (4, 6 e 8). Os TICs na Figura 2B mostram a separação e as transições únicas dos estereoisômeros HETE derivados de AA. A Figura 2C é uma representação de PGs, isoPs e LTs. A energia de colisão (CE), as transições MRM e o tempo de retenção (RT, min) foram otimizados usando um Waters 2695 LC acoplado a um Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra e estão listados na Tabela 3 para cada composto.

Tempo (min) % A % B 0 98 algarismo 3 98 algarismo 11 Seção 96.4 3.6 15 92 8 27 92 8 30 50 50 38 50 50 39 98 algarismo 45 98 algarismo

Tabela 1. Condições de gradiente de HPLC para a separação lipidômica da fase normal quiral. O solvente A é 100% hexanos e o solvente B é metanol/isopropanol (1:1).

Parâmetro de espectrometria de massa ambiente fonte APCI modo Íon negativo Comprimento do método 40 min Largura de varredura MRM 0,002 m/z Tempo de varredura MRM 0,15 seg Largura do pico MRM 0,70 FWHM Lente de tubo 164 V CID de origem 10 eV Q2 Gás de colisão 1,5 unidades Temperatura do vaporizador 450°C Temperatura capilar 250°C Corrente de descarga 0 μA Pressão do gás da bainha 25 unidades Pressão de varredura de íons 3 unidades Pressão de gás auxiliar 5 unidades

Tabela 2. Listados acima estão os parâmetros de espectrometria de massa otimizados para a medição de lipídios bioativos. Esses parâmetros são retirados de um Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

composto transição CE (eV) RT (min) 13-oxoODE 293,03 → 113,10 21 9.9 9-oxoODE 293,03 → 113,10 21 17.9 15-oxoETE 317,05 → 113,18 18 8.1 13 (R) - HODE 295,03 → 195,12 18 12.5 13 (S) -HODE 295,03 → 195,12 18 14.8 [2H4]-13(S)-HODE 299,03 → 198,12 18 14.9 9 (R) -HODE 295,03 → 171,10 18 13.7 9 (S) -HODE 295,03 → 171,10 18 21.2 [2H4]-9(S)-HODE 299,03 → 172,12 18 21.2 20-HETE 319,03 → 289,10 18 12.4 [2H6]-20-HETE 325,03 → 295,10 18 12.4 5(R)-HETE 319.04 → 115.04 16 15.7 5(S)-HETE 319.04 → 115.04 16 16.2 [2H8]-5(S)-HETE 327.04 → 116.04 16 16.4 12(R)-HETE 319,04 → 179,11 14 11.7 12(S)-HETE 319,04 → 179,11 14 12.3 [2H8]-12(S)-HETE 327,13 → 184,11 14 12.5 15 (R) -HETE 319,04 → 219,12 13 12.4 15(S)-HETE 319,04 → 219,12 13 15.9 [2H8]-15(S)-HETE 327,03 → 226,12 13 16.1 11(R)-HETE 319,04 → 167,11 16 11.1 11(S)-HETE 319,04 → 167,11 16 12.5 8(R)-HETE 319.04 → 155.09 16 11.7 8(S)-HETE 319.04 → 155.09 16 12.6 LTB4 335,03 → 195,10 18 32.0 [2H4]-LTB4 339,03 → 197,10 18 32.0 PÁG.2 351,03 → 271,15 18 31.2 [2H4]-PGE2 355.03 → 275.15 18 31.2 PGD2 351,03 → 271,15 25 32,5 [2H4]-PGD2 355.03 → 275.15 25 32,5 8-ISO-PGE2 351,03 → 271,15 18 37.4 11β-PGF2 353,03 → 193,11 25 27.6 [2H4]-11β-PGF2 357,03 → 197,11 25 27.6 PGF2α 353,03 → 193,11 25 33.1 [2H4]-PGF2α 357,03 → 197,11 25 33.1 8-iso-PGF2α 353,03 → 193,11 25 34.4 [2H4]-8-iso-PGF 2α 357,03 → 197,11 25 34.4

Tabela 3. Esta tabela lista os compostos detectados nos cromatogramas de íons totais da Figura 1A-C. A segunda coluna fornece a transição usada para MRM/MS, a terceira coluna lista a energia de colisão (CE, eV) e a última coluna lista o tempo de retenção (RT, min). Os parâmetros foram otimizados usando um módulo de separação Waters 2695 acoplado a um Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os padrões e padrões internos usados neste protocolo fornecem uma representação de um método lipidômico direcionado. Um módulo de separação Waters 2695 e Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra foram usados para a análise LC-MS e as configurações ideais de parâmetros podem ser encontradas nas Tabelas 1 e 2. Além disso, este protocolo de extração foi projetado para células aderentes, mas pode ser modificado para outros tipos de células, bem como outras matrizes biológicas, incluindo urina, sangue...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A maioria dos métodos bioanalíticos atuais disponíveis para a medição de lipídios bioativos não são tão extensos, pois não incluem cromatografia quiral de fase normal ou SID. A LC quiral de fase normal é crítica para a separação de enantiômeros e para ser capaz de distinguir entre metabolismo mediado por enzima ou ROS. O uso do SID garante que o erro humano ou as complicações que surgem durante a extração ou análise sejam levados em consideração durante a quantificação. Esses componentes adicionados, juntamente com o ECAPCI-MRM, tornam este o método mais sensível e seletivo disponível para a análise de lipídios bioativos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-oxo-6E,8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenóico-6,8,9,11,12,14,15-d7 ácidoCayman Chemical334250[2< / sup>H7< / sub>] -5-ox &# 8211; TE Padrão Interno
5S-hidroxi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenóico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácidoCayman Chemical334230[2< / sup>H8< / sub>] -5 (S< / em>) -HETE Padrão Interno
12S-hidroxi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenóico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácidoCayman Chemical334570[2< / sup>H8< / sub>] -12 (S< / em>) -HETE Padrão interno
15S-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eicosatetraenóico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácidoCayman Chemical334720[2< / sup>H8< / sub>] -15 (S< / em>) -HETE Padrão interno
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9 &alfa;, 11 &alfa; 15S-trihidroxi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 ácidoCayman Chemical316010[2< / sup>H4< / sub>] -PGF < sub> 2 e alfa; Padrão Interno
9&alfa;,11&alfa;,15S-tri-hidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácidoCayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a Padrão Interno
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12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-ácido eicosatetraenóicoCayman Chemical3458012-ox–TE Standard
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20-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-ácido eicosatetraenóicoCayman Chemical9003020-HETE Padrão
9R-hidroxi-10E, 12Z-ácidooctadecadienóicoCayman Chemical384059 (R< / em>) -HODE Padrão
9S-hidroxi-10E, 12Z-ácido octadecadienóicoCayman Chemical384109 (S< / em>) -HODE Padrão
13R-hidroxi-9Z, 11E-ácido octadecadienóicoCayman Chemical3860513 (R< / em>) -HODE Padrão
13S-hidroxi-9Z, 11E-ácido octadecadienóicoCayman Chemical3861013 (S< / em>) -HODE Padrão
9 &alfa;, 11 &alfa;, 15S-tri-hidroxi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oico ácidoCayman Chemical16010PGF < sub > 2 α Padrão
9&alfa;,11&alfa;,15S-trihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic ácidoCayman Chemical163508-iso-PGF2α Padrão
9&alfa;,11β,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oico ácidoCayman Chemical1652011β-PGF2 Padrão
9&alfa;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-ácido oicoCayman Chemical12010PGD2 Padrão
9-oxo-11&alfa;,15S-dihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical143508-iso-PGE2 Padrão
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical14010PGE2 Standard
5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenóicoCayman Chemical20110LTB4 Standard
9&alfa;,11,15S-trihidroxitromba-5Z,13E-dien-1-oico ácidoCayman Chemical19030TxB2 Fosfato Padrão
Tampolado SalinoGIBCO, por Life Technologies14190
Éter dietílicoSigma-Aldrich346136
DiclorometanoAcros Organics61030-1000anidro
N,N-diisopropiletilaminaSigma-Aldrich387649
Brometo de pentafluorilbenzilaSigma-Aldrich101052
Ácido clorídricoSigma-Aldrich320331
Hidróxido de potássioFluka00650
AcetonitrilaFisher ScientificA996-4
MetanolFisher Clorofórmio CientíficoA454-4
Fisher Scientific366927
HexanoFisher ScientificH303-4
IsopropanolFisher ScientificA464-4
EtanolDecon Laboratories2716
ÁguaFisher ScientificW7-4
Pasteur PipetasFisher Scientific13-678-200
Tubos de Centrífuga de Vidro de 10 mLKimble Chase73785-10Tampa de rosca
Tampas de Fenólico KimbleChase73802-13415
Coluna Chiralcel ADH ChiralTechnologies19325
Frascos de HPLCWaters60000751CV
Insertos de HPLCWatersWAT094171

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
  3. Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
  4. Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
  5. Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
  6. Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
  7. Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
  8. Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
  9. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
  10. Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
  11. Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
  12. Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
  13. Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).

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