Ovos e os revestimentos extracelular em torno de ovos com freqüência liberação de peptídeos, proteínas e pequenas moléculas que se comunicam com o esperma para guiá-los até o óvulo, promovendo assim a fecundação. Usando o esperma de rã que descrever e comparar duas classes de testes usados para detectar quimiotaxia esperma - ensaios de esperma acumulação e ensaios de monitoramento de esperma.
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Artigo de método
Dois tipos de ensaios para detecção de quimiotaxia Sapo Sperm
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quimiotaxia de esperma em invertebrados podem ser suficientemente robusto que um pode colocar uma pipeta contendo o peptídeo atraente em uma suspensão de espermatozóides e microscopicamente visualizar acúmulo de esperma em torno da pipeta 1. Quimiotaxia esperma em vertebrados, como sapos, roedores e seres humanos é mais difícil de detectar e exige ensaios quantitativos. Tais ensaios são de dois tipos principais - os ensaios que quantificar o movimento de esperma a uma fonte de chemoattractant, os chamados ensaios de acumulação de esperma, e os ensaios que realmente controlar as trajetórias de natação do esperma individual.
Ensaios de acumulação de espermatozóides são relativamente rápida permitindo dezenas ou centenas de testes a ser feito em um único dia, permitindo assim que as curvas de dose-resposta e cursos tempo para ser realizada de forma relativamente rápida. Estes tipos de ensaios têm sido amplamente utilizado para caracterizar muitos sistemas quimiotaxia bem estabelecida - por exemplo, quimiotaxia de neutrófilos para bacpeptídeos terial e quimiotaxia esperma para fluido folicular. Ensaios de monitoramento de esperma pode ser mais trabalhoso, mas oferecer dados adicionais sobre como chemoattractancts realmente alterar os caminhos que o esperma nadar tomar. Este tipo de ensaio é necessário para demonstrar a orientação do movimento de esperma em relação ao eixo gradiente chemoattrractant e visualizar curvas características ou mudanças de orientação que trazem os espermatozóides mais próximos do ovo.
Aqui descrevemos os métodos utilizados para cada um desses dois tipos de ensaios. O ensaio de acumulação de esperma utilizado é chamado de "duas câmaras" ensaio. Espermatozóides dos anfíbios são colocados em uma inserção de placa de cultura de tecidos com um piso de filtro de policarbonato com poros de diâmetro 12 mM. Pastilhas com os espermatozóides são colocados em poços de cultura de tecidos placa contendo tampão e um chemoatttractant cuidadosamente pipetado para o fundo poço onde o piso encontra a parede (ver Fig. 1.). Após a incubação, a inserção superior contendo o reservatório de esperma é cuidadosamente removed, esperma e na câmara de fundo que passaram através da membrana são removidos, peletizada e depois contadas por hemocitômetro ou citômetro de fluxo.
O ensaio de rastreamento de esperma utiliza uma câmara de Zigmond originalmente desenvolvido para a observação de quimiotaxia de neutrófilos e modificados para a observação de espermatozóides por Giojalas e colegas de trabalho 2,3. A câmara consiste de uma lâmina de vidro de espessura em que duas calhas verticais foram usinadas. Estes são separados por uma uma plataforma de observação mm de largura. Após a aplicação de um espermatozóide tampa de vidro, são carregados em uma calha, o agente chemoattractant para o outro eo movimento dos espermatozóides individuais visualizados por microscopia de vídeo. Imagens de vídeo são então analisados usando o software para identificar os movimentos em duas dimensões de células no plano xy como uma função do tempo (conjuntos XYT de dados) que formam a trajetória de cada espermatozóide.
Protocolo
1. Materiais e buffers usados
- Tampão de Ringer oócito (1,5 x OR2) contém 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 10 mM Hepes, pH 7,8. Tampão de fertilização (F-1) contém 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 0,06 mM MgCl 2, 0,5 mM Na 2 HPO 4, 2,5 mM Hepes, pH 7.8.
- Xenopus laevis água ovo é preparado de acordo com Sugiyama et al. 4. Brevemente descritos, recentemente gerou ovos de rã jellied são rodadas em um pequeno volume de F-1 buffer para 30 minutos eo meio condicionado removida....
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Discussão
Quimiotaxia de células de movimento pelo movimento amebóide ou flagelos-powered natação é encontrado em muitos contextos biológicos e estudo deste fenômeno exige a disponibilidade de testes prático e confiável. Alguns exemplos do fenômeno, como a atração de esperma para um ovo de ouriço do mar ou coleta de células do discoideum para formar um corpo de frutificação, têm um impacto visual imediato. Quantificação deste fenômeno tem sido feita em uma variedade de maneiras, como descrito por Eisenbach 18. Estes en.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos ao WM Keck Laboratory BioImaging para uso de sua estação de trabalho de vídeo microscopia. Este estudo foi financiado pela NSF conceder IBN-0615435.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do item | Companhia | Número Catálogo | Comentários |
| Placas de 24 poços | Becton-Dickinson | 35/1147 | |
| 12 milímetros de diâmetro exterior inserções com 12 mM de poros da membrana | Millipore | PIXP01250 | Nós usamos anteriormente Costar-Corning placa transwell # 3403-agora descontinuado |
| Zigmond câmara | Neuroprobe | Z02 | |
| Óleo de silicone | General Electric | SF1154 | Equivalente a Dow Corning 550 Fluid |
| Imagem J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Download gratuito em http://rsbweb.nih.gov/ij | Java programa que roda em Windows, Linux e Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering / ImageScience / Biomedical Imaging Group , Erasmus MC - University Medical Center Rotterdam | Download gratuito em http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java programa que roda em Windows, Linux e Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Download gratuito via http://www.virtualdub.org/index.html | Instruções de instalação no site da J Imagem em plugins, apenas para Windows |
| cellSens software | Olimpo | Consulte o site: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp produto? = 1070 | Controles e adquire imagens de uma variedade de câmeras. Também possui capacidade de processamento de imagem |
Referências
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C.
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Reimpressões e permissões
