Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Resumo

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Resumo

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) baseado em ^uma repórteres permitir a avaliação da quinase endógena e atividades da fosfatase em células vivas. Sondas tais tipicamente consistem de variantes do PCP e YFP, interveio por uma seqüência fosforilável e um domínio fosfo-binding. Após a fosforilação, a sonda conformação mudanças, o que resulta em uma mudança da distância ou da orientação entre PCP e YFP, levando a uma mudança na eficiência FRET (Fig. 1). Sondas de vários trabalhos foram publicados na última década, o monitoramento do equilíbrio atividade de quinases e fosfatases múltiplas, incluindo repórteres de PKA ^2, PKB ^3, PKC ^4, PKD ^{5, 6} ERK, JNK ^7, CDK ^18, Aurora B ⁹ e ⁹ Plk1 . Dado o design modular, sondas adicionais é provável que surjam no futuro próximo ^10.

Progressão do ciclo celular é afetada pelo estresse signaling caminhos ^11. Notavelmente, o ciclo celular é regulado de forma diferente durante imperturbável crescimento em relação a quando as células estão se recuperando do estresse ^12. Time-lapse de imagens de células através do ciclo celular, portanto, requer um cuidado especial. Isso se torna um problema particularmente quando se emprega imagens raciométrica, uma vez que duas imagens com uma alta relação sinal-ruído são obrigados a interpretar corretamente os resultados. Raciométrica FRET imagem das mudanças do ciclo celular dependentes em atividades quinase e fosfatase tem sido predominantemente restrita ao sub-seções do ciclo celular ^8,9,13,14.

Aqui, discutimos um método para monitorar FRET baseado em sondas utilizando imagens raciométrica todo o ciclo celular humano. O método baseia-se em equipamento que está disponível para muitos pesquisadores em ciências da vida e não requer conhecimento especializado de microscopia ou processamento de imagem.

Protocolo

1. Introduzir a sonda para células

1. Co-transfecção de células com uma sonda FRET-based e uma resistência plasmídeo conferir. Escolha um método de transfecção que seja eficiente na sua cela tipo de interesse. Para as células U2OS, padrão de cálcio métodos de transfecção fosfato dão resultados adequados ^15.
2. Selecione as células do antibiótico apropriado para pelo menos sete dias. Isso enriquece a quantidade de células que expressam a sonda e limita a quantidade de células com níveis de expressão tóxicos, ou níveis de expressão que afetam gravemente o ciclo celular.
3. (Opcional) Selecione para clones estáveis.
4. Usando célu....

Discussão

Monitoramento FRET todo o ciclo celular requer considerações que são menos cruciais na avaliação de curto prazo respostas a estímulos externos. Primeiro, a progressão do ciclo celular é facilmente perturbado por sinalização stress, exigindo que fototoxicidade é reduzido ao mínimo. Segundo, todos os repórteres podem afetar os processos celulares pela titulação fora quinases, fosfatases ou domínios de interação. A maneira provavelmente mais simples de avaliar se as condições experimentais são adequados é medir a duração d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Número Catálogo	Companhia
Leibovitz L-15, sem vermelho de fenol	21083-027	GIBCO, pela Life Technologies
DMEM + Glutamax-I	31966	GIBCO, pela Life Technologies
De soro fetal bovino (FBS)	SV30160.03	HyClone
0,05% Tripsina EDTA	SH30236.01	HyClone
Penicilina-estreptomicina	SV30010	HyClone
DPBS	14287	GIBCO, pela Life Technologies
Puromicina	P8833	Sigma-Aldrich