Nós descrevemos um método sensibilizada para identificar os reguladores pós-embrionário de expressão da proteína e localização no C. elegans Usando uma tela de genoma baseada em RNAi e um transgene integrado que expressa uma proteína fluorescente funcional marcada.
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Artigo de método
RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
C. elegans tem provado ser um sistema de modelo valioso para a descoberta e caracterização funcional de muitos genes e vias gene 1. Instrumentos mais sofisticados e recursos para estudos neste sistema estão facilitando a descoberta contínua de genes com fenótipos mais sutis ou funções.
Aqui nós apresentamos um protocolo generalizada, adaptado para a identificação de C. elegans genes com fenótipos pós-embrionário de interesse usando RNAi 2. Este procedimento é facilmente modificado para ensaio do fenótipo de escolha, seja por óptica de luz ou de fluorescência em um microscópio de dissecação ou composto. Este protocolo de triagem capitaliza os ativos físicos do organismo e ferramentas moleculares a C. elegans comunidade científica tem produzido. Como um exemplo, que demonstram o uso de um transgene integrado que expressa um produto fluorescente em uma tela RNAi para identificar genes necessários para a localização normal desteproduto em larvas fase tardia e adultos. Em primeiro lugar, utilizou-se uma biblioteca genómica comercialmente disponível RNAi com full-length inserções de ADNc. Esta biblioteca facilita a rápida identificação de vários candidatos por RNAi redução do produto do gene candidato. Em segundo lugar, gerou um transgene integrado que expressa nossa proteína fluorecently marcados de interesse em um fundo RNAi-sensível. Em terceiro lugar, por exposição dos animais a eclodidos RNAi, esta tela permitir a identificação de produtos de genes que desempenham um papel vital embrionário que de outra forma mascarar um papel pós-embrionário na regulação da proteína de interesse. Por último, este ecrã utiliza um microscópio composto equipado para a resolução de célula única.
Protocolo
1. Construção estirpe de Triagem
O desenho cuidadoso da estirpe de rastreio é crítica para o sucesso da tela e tem sido descrito em outro lugar 3. Para alguns investigadores, utilizando uma estirpe que expressa um produto visível a partir de um transgene é necessária para a experiência. Muitas cepas abrigando transgenes integrados estão disponíveis os pesquisadores CGC ou individual. Se uma estirpe transgénica é necessário para a tela, mas não estiver disponível, então ele pode ser gerada utilizando um método publicado como bombardeamento 4, UV / TMP 5, ou transposão Mos inserção 6. A fim de visua....
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Discussão
O método de triagem RNAi aqui apresentado permite uma análise rápida e sensível de produtos de genes necessários para um fenótipo (ou transgénico) normal pós-embrionário. O exemplo mostrado é um ecrã para genes envolvidos na localização subcelular de uma proteína fluorescentemente marcado. No entanto, este protocolo pode ser modificado para identificar genes que afectam outros fenótipos pós-embrionário de interesse.
Este método tira proveito de uma abordagem do gene candidato usando uma bibl.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Rick Padgett (Instituto Waksman, Rutgers University, NJ) para o dom do dbl-1 cDNA e Christopher Dr. Rongo (Instituto Waksman, Rutgers University, NJ) para um marcador de injeção. O laboratório do Dr. Barth Grant realizou o bombardeio arma gene para a integração baixo número de cópias do GFP dbl-1 construto. O René Garcia laboratório forneceu assistência técnica durante a criação de texIs100. O René Garcia, lints Robyn, e Hongmin Qin laboratórios prestou assessoria produtivo. Este trabalho foi financiado por fundos start-up do Departamento TAMHSC de Medicina Molecular e Celular. O escopo composto e co....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Agar NGM | Meio de crescimento de nemátodos | IPM Scientific, Inc | Pode ser preparado seguindo NGM protocolo ágar 25 |
| Meio M9 | 22mm KH 2 PO 4, 42mm de Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM de MgSO4 | 26 | |
| Agar-Agar | Merck | 1.01614.1000 | 2% em água para placas NGM. 4% em água para almofadas de lâmina de microscópio (autoclave inicialmente e de microondas para derreter a seguir). |
| Bacto Peptona | Becton Dickinson - Difco CP | 211677 | 0,25% |
| IPTG | Research Products International Corp | I56000-5.0 | 1 mM de concentração final, |
| carbenicilina | Research Products International Corp | C46000-5.0 | 50 ug / ml de diluição de trabalho |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson - Difco CP | 240230 | 20 g / litro |
| tetraciclina | Sigma | 268054 | 12,5 ug / ml de diluição de trabalho |
| hipoclorito de sódio | Qualquer marca | Lixívia a 5% | Use água sanitária fresco. |
| de hidróxido de sódio | Qualquer Marca | CAS 1310-73-2 | 5 estoque de N |
| Meio M9 | Wormlab Livro de Receitas | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 uM - 1 mM de diluição de trabalho |
| de azida de sódio | Fisher Scientific | S227 | 10 mM em M9 diluição de trabalho |
| 24-bem placa | Greiner Bio-One | 662160 | Distribuidor VWR |
| lâminas de microscópio | Qualquer marca | 75 x 25 x 1 mm | |
| cobertura deslizamentos de microscópio | Qualquer marca | 22 x 22 mm No.1.5 | Utilizar a espessura recomendada pelo fabricante microscópio. |
| microscópio composto | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objetivos e filtros para atender às necessidades do experimento. |
| bomba de mídia | Manómetro da bomba Varistaltic | Kate modelo # 72-620-000 | Utilize tubos e configurações adequadas para a máquina |
Referências
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, ....
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Reimpressões e permissões
