Artigo de método

Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

DOI:

10.3791/3453

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16 de fevereiro de 2012

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1School of Dentistry, Cardiff Institute of Tissue Engineering & Repair, Cardiff University , 2Shandong Qianfoshan Hospital, Shandong University School of Medicine, 3Dermatology and Ophthalmology Research, Institute for Regenerative Cures, University of California at Davis

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra métodos utilizados para estabelecer ambientes 2D e 3D em câmaras de design personalizado electrotactic, que pode acompanhar células In vivo / ex vivo Usando lapso de tempo de gravação no nível da célula única, a fim de investigar galvanotaxis / electrotaxis e outras respostas celulares ao dirigir atuais campos (DC) elétricos (EFS).

Resumo

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Endógenos campos eléctricos (EFS) ocorrem naturalmente in vivo e desempenham um papel crítico durante tecido / órgão de desenvolvimento e regeneração, incluindo a do 1,2 sistema nervoso central. Estes EFs endógenos são gerados por regulação celular de transporte iónico combinada com a resistência eléctrica de células e tecidos. Tem sido relatado que aplicada EF tratamento pode promover a reparação funcional de lesões da medula espinal em animais e humanos 3,4. Em particular, EF-dirigida a migração celular tem sido demonstrada em uma ampla variedade de tipos de células 5,6, incluindo as células progenitoras neurais (NPCs) 7,8. Aplicação de corrente direta (DC) FE não é uma técnica comumente disponíveis na maioria dos laboratórios. Nós descrevemos os protocolos de execução de FE DC para celular e culturas de tecidos previamente 5,11. Aqui apresentamos um vídeo de demonstração de métodos padronizados com base em uma intensidade de campo calculada para configurar uma 2Dd ambientes 3D para NPCs, e investigar respostas celulares a EF estimulação em ambas as condições unicelulares de crescimento em 2D, ea fatia de medula espinhal organotípico em 3D. O cordslice vertebral é um tecido destinatário ideal para estudar comportamentos NPC ex vivo, pós-transplante, porque a organização do tecido citoarquitetônicos está bem preservada dentro dessas culturas 9,10. Além disso, este modelo ex vivo também permite que os procedimentos que não são tecnicamente viável para controlar as células in vivo utilizando lapso de tempo de gravação ao nível da célula individual. É extremamente essencial para avaliar comportamentos de células em não só um ambiente 2D, mas também numa condição 3D organotípico que imita o ambiente in vivo. Este sistema permitirá que imagens de alta resolução usando tampa de vidro pratos à base de tecido ou cultura de órgão com rastreamento 3D da migração única célula in vitro e ex vivo e pode ser uma etapa intermediária antes de passar para a viparadigmas vo.

Protocolo

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1. Isolamento de células progenitoras neurais

  1. Dissecar cérebros inteiros de E14-16 camundongos e coloque em meio DMEM/F12 frio basal. Remova todas as meninges sob um microscópio anatômico e cérebros de transferência em uma placa de Petri 35 mm.
  2. Use fórceps finos para dissociar mecanicamente cérebros em fragmentos de tecido e transferi-los para um tubo de 15 ml, em seguida, centrifugar amostras a 800 rpm durante 3 min para remover os resíduos.
  3. Adicionar DMEM/F12 bFGF contendo e EGF e tritura-se com uma pipeta de 1 ml.
  4. Passar a suspensão de células através de um filtro de células para obter uma suspensão de célula única.

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Discussão

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Os protocolos que usamos são baseadas em estudos anteriores 5,11. Usando esses métodos de cultura, estável e elétrico condições atuais pode ser mantida enquanto a aplicação de um EF através de pontes de ágar, solução Steinberg e Ag / AgCl, para células ou fatias cultivadas em câmaras electrotactic custom-concebidas de dimensões padronizadas e precisas. A profundidade das câmaras pode ser ajustada para acomodar diferentes espessuras amostra 11, e, no caso de células, o tamanho da câmara pode ser mod.......

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Royal Society URF concessão UF051616, Reino Unido e do Conselho Europeu de Investigação StG concessão 243261 a BS. O trabalho em laboratório MZ é também apoiada por um Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia concessão RB1-01417.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
FGF-básico Humano Recombinante Invitrogen PHG0026 20 ng / mL
EGF humano recombinante Invitrogen PHG0311 20 ng / mL
N2 suplemento líquido (100X) Invitrogen 02048
DMEM/F12 médio (glucose elevada) Invitrogen 31330-095
Poli-D-Lisina Millipore Um-003-E
Natural do mouse laminina Invitrogen 23017-015
Fator de crescimento reduzido da membrana basal Matrix (Matrigel) BD Biosciences 354230
Tampão HEPES Gibco 15630
McIlwain tissue chopper O Laboratório de Engenharia de Mickle Co Ltd TC752-PD
A Dow Corning massa de silicone de alto-vácuo Sigma-Aldrich Z273554

Referências

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  1. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
  2. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
  3. B....

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