Summary
本文描绘出单个细胞荧光标记完好的小鼠视网膜神经人口的记录。通过使用双光子红外激发transgenetically标记的细胞是有针对性的膜片钳记录，研究他们的光反应，感受野特性和形态。
Abstract
学习的生理特性和完整的组织中的特定神经元的突触连接，这些细胞缺乏突出的形态特征，或显示一个人口密度低，是一种挑战。这尤其适用于视网膜无长突细胞，interneurons，包括大约30亚型在哺乳动物1分外多种形式类。虽然被塑造视网膜输出2的视觉处理的重要组成部分，这些亚型没有研究到现在功能方面，因为遇到这些细胞与记录电极是一种罕见的事件。
最近，众多的转基因小鼠线是可用的表达像促销员的控制下的绿色荧光蛋白（GFP）的膜受体或酶，是具体 的，只有在一个给定的组织3,4神经元的一个子集的荧光标记。这些预标记细胞，因此accessiblE定向微电极定位的微观控制下，允许他们在原地的生理特性的系统的研究。然而，激发的荧光标记物是伴随着风险的光毒性的活组织。在视网膜上，这种做法是另外的问题阻碍，激发光引起的光感受器适当的刺激，从而造成感光色素，漂白和光适应条件转移到视网膜电路。克服了这些缺点是使用一个锁模飞秒短脉冲激光红外激发交付。双光子激发提供的能量足够激发荧光基团，并在同一时间限制激发到一个小的组织体积减少光损伤5危害。此外，叶以来未能photopigments 6吸收红外光（850纳米）的视觉刺激反应的视网膜。
达到原位录音电从绿色荧光蛋白表达细胞在视觉上有针对性的双光子激发。视网膜是在黑暗中准备和维护，并可以通过显微镜的冷凝器（图1）预计的光刺激。膜片钳记录的光反应，可与染料填充揭示的形态和检查耦合到邻近的细胞间隙连接介导的染料，使靶细胞可以通过不同的实验水平上研究。
Protocol
以下说明假设实验者有一个基本的了解视网膜结构，膜片钳记录和双光子显微镜。建立和运行一个设置膜片钳和双光子成像系统的有用信息，请参阅文献[7-12]。
1。动物和组织准备
- 保持鼠标暗适应至少3小时。在此期间，准备1-2升胞组成的解决方案（毫米）125 2.5氯化钠，氯化钾，氯化钙，1.6 MgCl 2的，25日10碳酸氢钠3，D -葡萄糖和平衡pH值7.4 carbogen毒气（5％CO 2在O 2）在室温下。 一
- 二氧化碳过量颈椎脱位，安乐死在气密腔的鼠标。此过程，并应在黑暗中进行以下步骤。使用昏暗的长波长的光照（我们阻止短的波长由690纳米longpas的冷光源的过滤器），以支持个人愿景，同时保持动物的眼睛暗适应（小鼠只有在光谱的红色部分视力不佳）。在完全黑暗的使用红外线照明（> 800 nm的）的工作，并佩戴夜视镜。
- Enucleate眼用一双弯曲的虹膜剪刀和他们转移到一碟放置在解剖显微镜下的细胞外液。
- 开放与对春天的剪刀（我们第一次使用柳叶刀刺穿切割为起点）沿锯齿缘（视网膜及睫状体之间的边界）的眼球中取出的角膜和睫状体。取出镜头，仔细分离的视网膜色素上皮细胞。如果视网膜的方向是对你的学习至关重要，表明它像文献[12]。切断视神经和视网膜色素上皮之间，视网膜除去眼罩。注意视网膜表面的方向：卷曲的视网膜内的gangl离子电池的一面;外感光方。
- 删除玻璃体视网膜内层表面轻轻拉出一个木制牙签援助。为了这个目的，使用了细胞外液的体积小，只是涵盖的视网膜。视网膜玻璃体支牙签，可以拖动离心关闭。然后，应用短切口，沿视网膜的周边，以方便扁平化的组织。
- 转移到录音室视网膜感光的一面朝下，宣扬出去的玻璃底部（我们使用细刷）和固定的不锈钢尼龙串成帧。第二视网膜准备以同样的方式，并保持它在carboxygenated供日后使用外液暗适应。
2。录音
- 一个堂堂正正的激光扫描显微镜下安装在黑暗的录音室，并不断superfuse视网膜准备（不低于5毫升/公里n与细胞外液carboxygenated）加热到35 ° C。显微镜（还配备一个红外敏感CCD相机）坐落在一个吸震内的电子屏蔽法拉第笼的空气表。与非透明幕墙笼盖，继续在黑暗中准备。红色透明薄膜，我们还从电脑显示器屏幕关闭。
- 850-870 nm或更长的波长调谐红外激光，切换到锁模条件，并使用双光子激发可视化表达GFP的细胞。衰减激光的输出控制激光扫描软件在一定程度上的荧光细胞清楚地认识到，这只是足够使用中性密度过滤器
- 对于膜片钳记录，电流钳模式使用玻璃微量（我们用硼硅玻璃管材外径1.5毫米和0.225毫米壁厚）洋溢着细胞内组成的解决方案（毫米）125 K -葡萄糖酸，氯化钾10 0.5 EGT，10 HEPES，与氢氧化钾（给人一种吸管约5MΩ电阻）滴定至pH 7.4。请注意电压钳记录等其他实验条件下，需要不同的解决方案。如果需要注射染料，加入荧光探针（我们使用10毫米的Alexa Fluor 594）或示踪分子（3％Neurobiotin）。微管插入持有人，确保参比电极（氯化银线）与细胞外液在录音室接触。
- 施加压力的微量和目标的GFP表达细胞（我们用40倍水浸泡的目的; NA 1.25）。坐落在神经节细胞层（直接在视网膜的电流方向表面之下）在内核层的近端部分（编制内深约55-75微米），以及无长突细胞组织。微量的靶细胞，内界膜（胶质endfeet鞘）在视网膜接触前表面有被击穿。是公认的成功渗透赶出从微管尖和分离从底层的视网膜组织内界膜红外线传输IR - CCD相机拍摄的图像上，可以观察细胞内的解决方案。
- 办法从双光子图像进行比较SOMA的位置与图片的IR - CCD相机，记录微量的位置所需的细胞。请注意，这一步是不容易实现，需要一定的练习，因为绿色荧光蛋白表达细胞在确认以直接的微量红外线传输图像。正确的定位是实现时，微管尖端导致细胞表面可以看到在双光子图像的凹陷。替代此过程中，使用荧光染料在细胞内的解决方案（例如的Alexa Fluor 594，100微米），以揭示在双光子图像的微量位置。红外双光子激发允许足够的这种染料的荧光微量明显。为此，调整激光扫描软件，还包括红色荧光的检测范围。
- 从微量释放的压力，并获得一个全细胞膜片钳配置在电流钳模式。一个可用的录音应该给的-50至-55 mV的膜电位和持续至少20分钟。
- 目前创建一个刺激软件（我们使用，德国蒂宾根大学的托马斯欧拉，量子点），在计算机显示器上11的视觉刺激。调整要记录的细胞刺激的空间位置是：马克显示器上显示的IR - CCD相机和中心到它的一个斑点状的刺激传输图像的细胞位置。中性密度滤光片插入光路中的调整刺激强度。校准显示器的频谱和强度，见参考文献[14]。选择一个prolongeð刺激间隔（如15秒），以避免适应。包括一个光电二极管保持在光束路径上的刺激定时记录。
- 启动刺激的协议，并记录光响应（我们使用与非尖峰细胞过滤5 kHz时为10 kHz的采样率;穗录音建议像更高的采样率20千赫）。使用光刺激软件触发录音软件。
- 染料充填让前仔细回缩荧光剂扩散到30-45分钟的记录细胞从细胞的微管。小心不拉细胞体。如果使用非荧光示踪Neurobiotin，它需要通过有约束力的可视化链霉亲和共轭一个荧光团（我们在夜间使用链霉亲和素- Cy3标记，1:400 4 ° C，经过20分钟的视网膜多聚甲醛固定;染料耦合研究链霉亲和孵化，可以延长至3天）。另外，注射剂也可以进行与尖锐的电极（> 100MΩ）当染料驱动iontophoretically刺穿细胞（矩形脉冲：0.25-1 NA，100毫秒，间隔100毫秒，总时间3-6分钟）。
3。代表性的成果：
以下结果来自对鼠标的研究表达绿色荧光蛋白（GFP）启动子下，儿茶酚胺合成的限速步骤（TH：GFP的小鼠）的酶催化酪氨酸羟化酶 13,14 。基于GFP信号的两个不同的细胞群的亮度分辨（图2A）。细胞中表达的GFP水平较高，拥有位于内核层（INL，图2A），或在神经节细胞层（保利协鑫，图2B）流离失所的胞体和内网状层中的分层（图2C，彩光） 。他们被确定为2型细胞14-16的形态（图3）可以系统地进行研究，并选举rical活动（图4），即使它的人口密度仅为250细胞/毫米2。
图1。实验装置示意图。双光子激发（红色点缀光路）荧光团，表达完整的视网膜细胞，使视觉由微管（绿色发射光路）的目标。通过冷凝器显微镜（黄色光路）预计的光刺激，视网膜细胞对光反应记录。
图2。绿色荧光蛋白表达细胞在视网膜的一个TH flatmount：GFP的鼠标。可以区分两类人群的GFP信号的亮度：1型细胞（DA细胞）位于显示弱荧光（A，见箭头）的INL和强烈的标记2型细胞INL（A，见箭头）或在保利协鑫（B）和树突状分层阶层的IPL S3（三）在流离失所的细胞体。比例尺，50微米。
图3 2型细胞注射示踪Neurobiotin的形态。示踪剂后来可视化链亲和素- Cy3标记的绑定（洋红色）。的显微照片，这也是描绘的GFP信号（绿色），是一个覆盖GCL和IPL的形象栈的投影。比例尺，50微米。
图4。位于保利协鑫2型细胞对光反应。在暗的范围内增加强度的照明白光满场的响应模式。刺激强度是每秒每杆（RH * /棒/ S）photoisomerizations。用于更好的不同的是一个3秒的长时间刺激离子刺激发病响应元件（ON响应）和偏移量（OFF响应）。
Discussion
这种方法提供了可能性研究的完整的视网膜视觉引导下的具体神经元的电性能，不影响视网膜adaptational条件。它特别适合于细胞，目前不佳而由于人口密度低，像大多数人口的无长突细胞研究的表征。双光子激发允许高分辨率和高对比度的影像，甚至较深部位的组织17，一个准确的定位的前提和成功的膜片钳细胞，特别是在其细胞体的高密度的INL。
孤立的小鼠视网膜是可行的实验条件下3-4小时。如果第二个视网膜下连续carbogen毒气完全黑暗中，它保留紫色的原色感光色素，可用于后整理与第一视网膜的实验。在开始的时候，针对选择与在视网膜wholemount微量细胞是一个挑战，需要一些练习，尤其是当在黑暗中工作。包括在微荧光染料，可以简化程序，因为细胞和微管是在同一时间的双光子激发下可见。然而，将组件添加到细胞内的解决方案可能阻碍gigaseal形成或导致录音的质量遭受。一旦成功地实现了，一个好的记录可以持续约1小时
而红外激发光本身仅仅是视网膜感光细胞吸收不足，兴奋表达GFP的细胞发出的光在可见光谱部分。然而，荧光团很高兴，只有在一个小焦量，是不会改变视网膜adaptational条件。所有的多，激发只需要为目标，录制的光反应时，可以切换。
该usefulnESS是已经证明这种方法通过研究特定人群的无长突细胞14,18从电生理记录，否则会一直只能由事故12。最后，这个强大的技术，可以进一步扩展，包括药理学方法 14， 钙离子成像 19或使用注射的细胞免疫研究或电子显微镜。通过这种方式，一个特定类型的细胞在视网膜的电路的功能定位可以揭开。
Disclosures
小鼠进行处理，并按照指引，对动物福利机构，由德国政府颁发的动物实验的法律安乐死。
Acknowledgments
这项工作是由德意志研究联合会（WE849/16 1 / 2，KD和RW）的支持。我们感谢托马斯欧拉（Töbingen德国）软件量子点的光刺激。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
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