Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional no córtex do rato In vivo. Baseia-se na imagem de dois fotões concomitante de dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) e da microcirculação cortical. Este método é útil para a análise de alta resolução de fornecimento de oxigénio do tecido.

Resumo

A capacidade do cérebro para funcionar a níveis elevados de demanda metabólica depende de suprimento contínuo de oxigênio através do fluxo sanguíneo e difusão de oxigênio nos tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo experimental visualizados e metodológico para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional e inferir gradientes de oxigênio perivasculares do córtex mouse. Baseia-se a relação não linear entre dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) intensidade de fluorescência endógena e da pressão parcial de oxigénio no tecido, onde o tecido observadas NADH fluorescência aumenta abruptamente a níveis de tecidos de oxigénio abaixo de 10 mmHg ^1. Nós usamos dois fótons excitação a 740 nm que permite a excitação concomitante de fluorescência intrínseca tecido NADH e plasma sanguíneo em contraste com Texas Red-dextran. As vantagens deste método sobre as abordagens actuais incluem o seguinte: leva vantagem de um sinal de tecido intrínseca e pode ser realizada usando o padrão de dois fotões in vivo imenvelhecimento equipamento, que permite a monitorização contínua em todo o campo de visão com uma resolução de profundidade de aproximadamente 50 um. Nós demonstramos que as áreas cerebrais de tecido mais afastadas dos vasos sanguíneos cerebrais correspondem a áreas de mananciais vulneráveis ​​que são os primeiros a tornar-se funcionalmente hipóxica após um declínio na oferta de oxigênio vascular. Este método permite a oxigenação imagem microrregional cortical e, portanto, útil para examinar o papel da alimentação inadequada ou restrito de oxigênio nos tecidos em doenças neurovasculares e derrames.

Protocolo

1. Preparação do animal para imagiologia

Nota: Nós usamos adultas camundongos C57BL. Diferentes linhagens transgênicas podem ser utilizados dependendo da questão de pesquisa. Cirurgias microvasculares e oximetria de pulso são facilitadas em camundongos com pele branca (por exemplo, estirpe FVB).

1. Preparar o sítio cirúrgico na bancada. Todos os instrumentos cirúrgicos precisam de ser autoclavada ou desinfectado com etanol a 70%.
2. Inserir uma sonda rectal, e medir continuamente a temperatura corporal do animal ao longo do procedimento
3. Anestesiar o mouse utilizando inicialmente 5% isoflurano. Em 15-30 s, quando o animal não estiver em movimento, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C), e aplicar uma máscara facial para o fornecimento contínuo de ar contendo 1,3-1,5% de isoflurano). Certifique-se que o animal não está respondendo a um estímulo da dor (por exemplo pitada cauda).
4. Use gel de lágrima artificial para cobrir os olhos do rato, para evitar a exposição ao ar seco.
5. Usando um barbeador elétrico, remova f cabelorom da cabeça e de ambas as coxas. Aplique removedor de pêlos (por exemplo, Nair) na coxa por 2 minutos, e, em seguida, limpe-a com cuidado para remover os pêlos restantes. Este coxa será usado para a oximetria.
6. Desinfectar o couro cabeludo usando um 10% de solução de povidona-iodo e etanol a 70%.

2. Preparação da janela aberta crânio craniana

1. Começando 5 milímetros caudal do crânio, fazer uma incisão no couro cabeludo com uma tesoura, e avançar um centímetro. Mover pele para os lados para expor o crânio.
2. Para remover as membranas no topo do crânio aplicar solução de cloreto de 10% férrico para o topo do crânio. Limpe o excesso de solução, e raspe as membranas acabar com 45 ° de ângulo # 5 pinças. É importante para preparar o local com cuidado, de modo a assegurar que a placa de cabeça pode ser firmemente ligado ao crânio (passos # 4-6).
3. Usando um microscópio de dissecção, identificar a área de interesse. Note-se que as suturas cranianas deve ser evitado porque o crânio cuma quebra de forma imprevisível ao longo destas linhas.
4. Aplicar uma fina camada de cola rápida (por exemplo, locktite 454) em torno das bordas da janela da placa de cabeça (Figura 1). Posicionar a placa de cabeça de tal maneira que a área de interesse está exposta na janela. Aplique uma leve pressão sobre a placa de cabeça. Aplicar uma pequena quantidade de cimento dental para polimerizar a cola-se rapidamente. Mantenha por 10 segundos, enquanto a cola é polimerização.
5. Aplicar uma pequena quantidade de cola rápida para as bordas da janela para selar a placa de cabeça e do crânio. Aparafuse a placa de cabeça para o detentor de animais no âmbito da dissecção.
6. Usando o Microtorque broca II fixado em 6000 rpm e uma IRF broca 005, remover toda a cola extra do crânio e da placa de cabeça. Qualquer cola restante sobre a placa de cabeça deve ser removido, uma vez que, de outro modo interferir com a fixação da tampa de vidro.
7. Definir a broca a 1000 rpm, e iniciar a perfuração do crânio, fazendo um círculo dentro da janela de placa de cabeça, diâmetro ~ 5 mm. Use leves movimentos radicais como se você estivesse desenhando com um lápis muito macio. Pare de perfuração a cada 20-30 segundos para remover o pó de osso que usa ar comprimido.
   Nota: A forma da abertura na placa de cabeça permite o acesso adicional para a broca (por cirurgião esquerda e destro), o que torna mais fácil para criar uma janela circular craniana. Além disso, os dois furos em forma de ímpares proporcionar o espaço necessário para inserir um eléctrodo de Clark-eléctrodo ou vidro-no tecido cerebral sob a janela do crânio para medições adicionais polarográficas ou electrofisiológico.
8. À medida que a perfuração progride, uma toca é formado em torno do crânio intacto no centro. Tenha cuidado para não picar através do crânio diluído, mas para fazer isso toca da mesma espessura. Tenha cuidado extra em torno de grandes vasos de sangue, que não deve ser comprometida e, se possível, nem sequer tocou.
9. Use uma "perna" de pinças # 3 para levantar ("flick off") do osso no centro da janela. Aplicar uma gota de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) sobre a janela.
10. Wipe aCSF suavemente, utilizando um canto do papel de tecido mole (por exemplo, Kimwipe). Geralmente a dura-máter é danificado em um ou mais locais em torno da borda da janela. A partir de um destes locais, levante cuidadosamente e depois remover a dura-máter a partir da superfície do cérebro, utilizando pinças 45 ° ângulo # 5. Ao escolher o local em que começar a remover a dura-máter, evitar as áreas adjacentes às grandes vasos sanguíneos. Se ocorrer sangramento, aplicar uma gota de aCSF e esperar por 2-3 min para o sangramento menor para parar.
11. Preparar 0,07% de agarose de baixo ponto de fusão dissolvido em aCSF) Traga a agarose fundida à temperatura do corpo. Enxugar o excesso de aCSF a partir da superfície do cérebro. Despeje a agarose na janela, e cubra com uma lâmina de vidro. Pressione o vidro suavemente para fazer um contacto entre o vidro ea placa de cabeça, e esperar 10-20 seg até que a agarose é sólido.
12. Remover o excesso de agarose a tampa de vidro, usando uma pinça e papel de tecido mole.
13. Coloque uma pequenaquantidade de cola rápida em torno do vidro para colar o vidro para a placa de cabeça. Aplicar uma pequena quantidade de cimento dental para solidificar a cola (Figura 1).

3. A injeção intravenosa e monitorização da oxigenação arterial

Nota: Foram utilizados rotineiramente na veia femoral para aplicação intravenosa de Texas Red, em vez de na veia da cauda. Isto é porque injecções na veia femoral fornecer injecções de bolus seguras e reprodutível do corante.

1. Ligue o animal parcialmente sobre a expor o interior da coxa esquerda. Use fita adesiva para prender o animal nesta posição.
2. Aplicar esfrega anti-séptico e, em seguida etanol a 100% para a pele.
3. Faça uma incisão ao longo da coxa medial do joelho até a sínfise púbica. Separados tecidos moles por dissecção romba, usando uma pinça # 5.
4. Encher seringa de 1 ml com 130 uL de Texas Red (2,5 mg / ml). Coloque uma nova agulha (calibre 30), e dobre-o cuidadosamente a 30 °, mantendo o bisel para cima. Preencha o wi agulhath Texas Red solução.
5. Sob um microscópio de dissecção, inserir a agulha na veia femoral e injectar 100 uL de Texas Red. Remova a agulha e pressione levemente a veia com uma gaze para parar o sangramento.
6. Feche a pele usando sutura 4-0.
7. Para o monitoramento contínuo de sangue SpO ₂ (para garantir a oxigenação adequada do sangue) coloque a sonda do oxímetro na coxa direita (de que o cabelo foi previamente removido).

4. Dois fótons de imagem

Nota: Nós usamos uma Olympus Fluoview1000 multifotônica sistema de imagem (vertical) com um Spectra-Physics Maitai HP femtosegundo DeepSee Ti: Sa laser como uma fonte de excitação. Para imagem, usamos × 10 NA 0,45 (Zeiss C Apochromat-), ou × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) imersão em água objectivos. Tomamos imagens em 12-bit de profundidade em uma resolução de 512 × 512 pixels com um pixel tempo de permanência de 2 mS. O NADH e Texas-Vermelho-dextran são simultaneamente excitado a 740 nm, e fluorescence é separada da luz de excitação utilizando um espelho dicróico / perto-IR-bloqueio combinação de filtro (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, EUA), dividido em dois canais utilizando um espelho dicróico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, EUA), e passa-banda filtrada (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laser de energia medido após o objectivo era 10-20 mW para imagens em camada I e 20-50 mW para a imagem latente na camada II.

1. Transferir o rato cirurgicamente preparado para a fase de microscópio. Tome uma visão inicial do site janela craniana com uma iluminação de campo claro com ampliação de 4x para usar como um mapa de referência para o registro com maior ampliação de dois fótons angiografias.
2. Amplie a área de interesse utilizando magnificação de × 10. Seleccionar uma área de interesse, em camadas corticais I ou II (até 150 um abaixo da superfície pial). Se ampliação maior for desejado, utilizar × 25 objectivo
3. Iniciar gravar a série temporal (Figurasre 2). Sugerimos utilizando uma média de 3-5 quadros para aumentar a qualidade da imagem.
4. Induzir hipoxemia adicionando N2 50% para o ar que o animal está respirando. Isto trará o nível de O2 a 10%. Verifique hipoxemia através do monitoramento de dados do oxímetro.
5. Continuar a gravar a série tempo através de hipoxemia (por exemplo, durante 30 segundos) e, após o nível de O2 normal é restaurado.
6. Recolher dados para o cálculo da distribuição de oxigénio através da detecção, medição e quantificação da área de cilindros de tecido hipóxia e oxigenado em torno dos vasos sanguíneos.

5. Informática

1. Determinar o cilindro de tecido Krogh raio R. Isto pode ser feito manualmente (Figura 3) através da medição da distância entre o centro do vaso sanguíneo e do limite em que a fluorescência de NADH elevada for detectada.
2. Alternativamente, use o computacional investigador independente determinação semi-automatizada do raio R tecido cilindro eo blo Centralod r vaso que foi descrito anteriormente ¹ em forma complementar e resumidos na secção discussão deste protocolo.
3. Determinar a área de hipóxia usando open-access software de análise de imagem, por exemplo, ImageJ. Para fazer isso, usar o sinal de NADH, definir um limite que delineia a área de alta intensidade NADH e, em seguida medir a área com fluorescência elevada tecido NADH.

6. Os resultados representativos

A Figura 2 mostra um vídeo de NADH / angiografia imagens durante a hipoxemia transitória (para a versão em PDF desta Figura, selecionadas imagens estáticas foram usados). A concentração de oxigénio inspirado foi diminuída de 21% a 10% durante um período de 3 min. Este nível de hipoxemia induzida experimentalmente é suficiente para induzir hipóxia grave no córtex cerebral. Hipóxia conduziu a um aumento na fluorescência de NADH, inicialmente nas superfícies que são mais afastada do fornecimento de sangue arterial. Observe o tecido NADH afiadafronteiras, que representam limites de tecido observáveis ​​de difusão de oxigênio da microcirculação cortical. A imagem da Figura 3 mostra a geometria dos limites de oxigénio de difusão circundantes vasos cerebrais. É possível deduzir Krogh diâmetros dos cilindros a partir destes limites, tal como descrito anteriormente ^1.

Figura 1. (A) do rato com a janela craniana preparado para geração de imagens. (B) Dimensões da placa de cabeça.

Figura 2. Endógena NADH fluorescência verde visualizado com dois fotões de imagem através da janela craniano, aproximadamente 50 um abaixo da superfície pial. Os vasos sanguíneos são visualizados com Texas Red dextrano. Oxigénio no ar inalado foi reduzida para 10% durante 3 min, e então restaurado para 21%. Barra de escala: 50 ìm.

Figura 3. Geometria do NADH limites de fluorescência. Contorno amarelo mostra limite de hipóxia funcional; círculos azuis mostram projetadas oxigenados (Krogh) cilindros. As linhas azuis mostram raios cilindro; números mostram raios em micrômetros.

Discussão

Informações de alta resolução espacial sobre a difusão do oxigênio é importante para entender como o fluxo de sangue no cérebro é regulado para fornecer oxigênio para as células cerebrais, e para atender à demanda metabólica. Tradicionais medições de oxigênio polarografia utilizando eletrodos de Clark estilo de vidro são altamente invasivos e têm baixa resolução espacial ^2-3 e tempo de resposta significativa (segunda faixa). Até agora, o método não invasivo apenas para medir a pO ₂ no tecido cerebral é têmpera fosforescência, onde a taxa de decomposição da sonda animado é proporcional à concentração de oxigénio ^4. Este método proporciona concentrações de oxigênio precisos, mas requer um corante de propriedade e um sofisticado sistema de imagens tecnicamente fosforescência vida. Aqui, nós demonstrar uma abordagem direta e simples que podem ser realizados em um sistema de imagem padrão de dois fótons com dois canais flurescence. Nossa abordagem tira proveito de um sinal de tecido intrínseco ⁵ and só requer visualização contrastante da microcirculação cortical. Devido ao aumento não-linear, essencialmente binária de NADH fluorescência a funcionalmente limitando concentrações de oxigénio ^1, o aumento da fluorescência intrínseca NADH é observada apenas em áreas com significativo, hipoxia metabolicamente limitante. Uma implicação importante é que os limites de tecido de difusão de oxigênio a partir de microvasos corticais são diretamente observáveis ​​por mudanças de intensidade de fluorescência de forma cilíndrica NADH endógeno. Referimo-nos a estas estruturas como as garrafas de Krogh, porque o conceito de estruturas de forma cilíndrica que definem o volume oxigenado de tecido circundante de um vaso sanguíneo foi introduzido por agosto Krogh e foi recentemente observada experimentalmente usando dois fotões NADH imagem ^1. Imagens cilindros Krogh podem ser coletadas em 3D, tendo uma pilha z-de quadros de imagem. Eles são especialmente proeminente na vizinhança das arteríolas penetrantes e eles são wit congruenteh capilar esgotados cilindros ^1,4 tecidos periarteriolares.

Para proporcionar uma determinação objectivo do raio R Krogh tecido do cilindro (ver Secção 5.2) foram medidos os seus valores de intensidade de pixel radiais dentro de um segmento bem definida entre o centro do cilindro e do limite exterior usando a função de Matlab "improfile". O limite exterior do segmento deve ser escolhido para estender com uma margem de segurança para além do limite visível. Para melhorar o nível de sinal-para-ruído que averageed sobre todas as linhas radiais necessários para cobrir o segmento de cilindro visível em passos de 1 °. O resultante perfil de intensidade média radial dentro do segmento exibiram um aumento acentuado que correspondia ao R visível do tecido de limite. O que se encaixam uma função sigmoidal (por exemplo, a função de Boltzmann) para o perfil de intensidade média radial e utilizou o seu ponto de inflexão (também conhecido como x ₀₎ como uma definição de R. O correspondente dois-pHoton microangiography (Texas-vermelho) revelou a secção transversal de um vaso sanguíneo central solitário no centro do cilindro. O diâmetro do vaso sanguíneo central pode ser aplicada directamente para determinar r.

Dois fótons NADH imagem fornece a mesma resolução espacial que a imagem de alta resolução simultânea do microangiography cortical. Uma característica importante para a aplicação quantitativa deste método é que p ₅₀ do aumento de fluorescência de NADH foi medido como sendo de 3,4 ± 0,6 mm Hg ¹ e que a intensidade de fluorescência de NADH como uma função do tecido microrregional pO ₂ pode ser descrito matematicamente com uma função sigmoidal. . Nós mostramos que esta técnica permite um para identificar áreas do cérebro que são mais vulneráveis ​​a hipoxia (diminuindo o teor de oxigénio no ar a 10%). Mostramos também que a difusão do oxigênio segue um padrão perivascular geométrica simples.

Um critpasso ical para este método é a qualidade da preparação janela craniana. A cirurgia deve produzir danos mínimos de modo a não perturbar o fluxo sanguíneo para a área exposta. Uma preocupação é que, em uma preparação cirurgicamente comprometida, o córtex sob a janela pode ser hipóxico para começar, impedindo qualquer experiências significativas. Uma janela bem preparado craniana deve ter intactas vasos sangüíneos maiores e menores, com fluxo de sangue vivo em todos os tipos de navios e sem sangramento significativo ao longo das bordas. Sob condições de normóxia (PaO2 mmHg 80-100, Sp O2 97-99%), o parênquima cerebral deve apresentar uniforme, homogênea, sem fluorescência NADH conspícuos, retalhos de tecidos brilhantes com fluorescência NADH elevada.

A restrição física fundamental de nossa abordagem é limitada profundidade de penetração. O azul-verde de fluorescência de NADH no cérebro é rapidamente atenuada pela absorção de hemoglobina e de espalhamento do tecido a estes comprimentos de onda. Mesmo com abertura numérica elevada de água (por exemplo, 1,05)objetivas de imersão de dois fótons NADH imagem está actualmente limitada a cortical camadas I e II. Esta limitação é cientificamente relevante porque o metabolismo da energia no, ou em proximidade à matéria branca provavelmente diferem de matéria cinzenta. No entanto, a investigação de profundas estruturas corticais tais como camadas IV-VI ou estruturas subcorticais tais como tratos de substância branca ou o corpo estriado exigiria a utilização de microlentes especializadas, tal como descritos no córtex do rato in vivo ^6.

NADH baseado medição dos limites de difusão de oxigénio pode ser especialmente útil quando combinado com outras medições, tais como as análises de hiperemia funcional, e detecção de taxas de fluxo capilar ^7. Por exemplo, esta técnica pode ser adaptado para visualizar hipoxia em acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) modelos. A geometria simples de difusão de oxigénio permite prever o gradiente de oxigénio em leitos microvasculares em circunstâncias em que a densidade capilar é devincado ⁸ (por exemplo, AD ⁹⁾ e para examinar se as regiões cerebrais de tecido com densidade capilar reduzida estão em risco aumentado de dano devido à hipóxia microstrokes. A capacidade de imagem microregionally também permite que um para examinar a geometria e tamanho de microstrokes de tecido e de determinar o volume de tecido no qual ocorre a hipóxia, bem como a relação entre a hipóxia tecidual e subsequente morte neuronal ou remodelação capilar ^10.

Finalmente, uma vez que aumentos de fluorescência NADH endógeno são a conseqüência direta da disfunção mitocondrial aguda, esse método cria a oportunidade de usar imagens de NADH como repórter específico para o metabolismo de energia neural ¹¹ e um proxy para a disfunção mitocondrial.

Em conclusão, dois fotões de imagem de fluorescência de NADH endógena é uma ferramenta simples, pouco exigente que pode ser usado para compreender a entrega de oxigénio eo consumo no cérebro sob tanto normaise nos estados patológicos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Almofadas de aquecimento	Além de calor Bodi
Pomada oftálmica (lágrimas artificiais)	Pfizer
Povidona-iodo solução a 10%	Betadine
Solução de cloreto férrico a 10%
Cimento	Stoelting Empresa	51456
454 cianoacrilato	Loctite
aCSF	Harvard Apparatus	597316
Microtorque II handpiece kit	Pearson	R14-0002
Broca IRF 007 bits de	Belas Ferramentas Ciência	19008-07
Fórceps # 5	Belas Ferramentas Ciência	11295
Fórceps # 5/45	Belas Ferramentas Ciência	11251-35
# 0 lamela de vidro	Electron Microscopy Sciences	63750-01
Tubo fotomultiplicador	Hamamatsu	HC125-02
Ti: Sapphire laser de Mai-Tai	Spectra Physics-