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Artigo de método

Medição de γHV68 Infecção em Camundongos

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DOI:

10.3791/3472

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22 de novembro de 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

γ-Herpesviruses (γ-HVS) estabelecer ao longo da vida a persistência em seus hospedeiros. Infecção de camundongos com γ-HV68 oferece uma geneticamente tractable In vivo Modelo para a caracterização do ciclo de vida / patogênese da γHVs. Este protocolo descreve a detecção e quantificação de γHV68 infecção em fase aguda e após a infecção latente por placas formadoras de centro, infecciosas, e ensaios de qPCR.

Resumo

γ-Herpesviruses (γ-HVS) são notáveis ​​por sua capacidade de estabelecer infecções latentes de células linfóides 1. A gama de hospedeiros humanos estreito de γ-HVS, como EBV e KSHV, foi severamente prejudicado estudos detalhados patogênicos. Murino γ herpesvirus-68 (γHV68) ações extensa semelhanças genéticas e biológicas humanas com γ-HVS e é um patógeno natural de roedores murids 2. Portanto, a avaliação de γHV68 infecção de camundongos cepas puras em diferentes estágios da infecção viral fornece um modelo importante para a compreensão do ciclo de vida viral e patogênese durante γ-HVs infecção.

Após inoculação intranasal, γHV68 infecção resulta em viremia aguda no pulmão, que é posteriormente resolvido em uma infecção latente de esplenócitos e outras células, que pode ser reativada ao longo da vida do hospedeiro 3,4. Neste protocolo, vamos descrever como usar a placa de ensaio para avaliars título de vírus infeccioso no pulmão homogeneizados em monocamadas de células Vero na fase inicial (5-7 dias) do pós-infecção intranasal (dpi). Quando a infecção aguda é em grande parte limpa 2-3 postinfection semanas, uma infecção latente de γHV68 é estabelecida em torno de 14 dpi e mantido posteriormente no baço dos camundongos. Infecção latente geralmente afeta uma população muito pequena de células nos tecidos infectados, segundo o qual o vírus permanece latente e desliga a maioria de sua expressão gênica. Esplenócitos latentemente infectadas pelo vírus espontaneamente reativar sobre explanting em cultura de tecidos, que pode ser reproduzido por um centro de ensaio infecciosas (IC) para determinar a carga viral latente. Para melhor estimar a quantidade de cópias do genoma viral na forma aguda e / ou tecidos infectados de forma latente, quantitativa PCR em tempo real (qPCR) é usado para a sua sensibilidade máxima e precisão. As análises combinadas dos resultados da qPCR e placa de ensaio, e / ou ensaio IC irá revelar os perfis espaço-temporal de viralreplicação e infectividade in vivo.

Protocolo

O protocolo a seguir irão descrever o estudo dos títulos de vírus e de cargas genoma viral no ciclo de infecção lítica e latente de γHV68 em camundongos, o que teoricamente pode ser usado para avaliar a infecção por outros vírus partilha estilo de vida semelhante ao de γHV68.

1. Amplificação de γHV68

  1. Descongelar um frasco frozen da γHV68 em 37 ° C banho-maria.
  2. Adicionar inóculo viral para NIH3T12 ou cultura de células 3T3 (~ 50% confluência) em 10 pratos cm e cultura as células infectadas a 37 ° C em 5% CO 2.
  3. Examine a cultura por microscopia de efeito citopático (CPE) e recolher a mídia no momento em que mais de 80% das células mostram CPE 4 ~ 5 dias após a infecção. Para maximizar o rendimento de vírus, a cultura de células infectadas pode ser congelado e descongelado duas vezes para liberar todos os associados a células γHV68.
  4. Centrífuga a mídia coletados em 1000 rpm por 5 min à temperatura ambiente (RT) para remover restos celulares.
  5. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos (alta velocidade tubo de centrifugação), sem tocar os restos celulares na parte inferior.
  6. Alta velocidade de centrifugação a 12.000 rpm (para Sorvall SA-600) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 horas de concentração de partículas virais.
  7. Descartar o sobrenadante em solução de água sanitária 10γ e cuidadosamente re-suspender o pellet (vírus e restos celulares residual) com 1 ml de soro livre de DMEM. Transferir o pellet ressuspendido em um tubo de 1,5 ml micro centrífuga e misturar bem em vórtice.
  8. Centrifugar por 2 minutos na velocidade máxima para remover restos celulares residual e transferir o sobrenadante (stock de vírus) para um novo tubo. Este é o estoque final para a infecção viral. O título do estoque de vírus é determinado pelo ensaio de placa (veja abaixo).

2. A infecção intranasal de camundongos com γHV68

  1. Infectar camundongos em ~ 6 semanas de idade com 1.000 ~ 5.000 unidades formadoras de placa (UFP) de camundongos por γHV68.
  2. Anestesiarcamundongos pela injeção de cetamina / xilazina (60 mL / mouse de uma mistura de 80 mg / ml de ketamina e 12 mg / ml de xilazina) na cavidade peritoneal. Monitorar anestesia apertando o dedo do pé camundongos. Geralmente, leva ~ 5-10 min. Se os ratos não são totalmente anestesiados, eles vão espirrar o vírus.
  3. Quando o mouse está totalmente anestesiado, use uma pipeta para inocular ~ mL de PBS contendo 30 γHV68 (15 mL em cada narina) a camundongos gota-a-gota lenta mas firmemente. Certifique-se o mouse é realmente inalar as gotas sem tentar formar bolhas.
  4. Permitir que o mouse para se recuperar por 10-15 min e monitorar o bem-estar dos ratos (por exemplo, a consciência de respiração, etc) antes de devolvê-los para a jaula. Os animais são verificadas diariamente para a doença e adequação de alimentos, água, e as condições de cama. Se os sinais clínicos de dor, doença ou angústia desenvolver, de diagnóstico de rotina para determinar a etiologia será conduzida. Animais que perdem mais de 20% do seu peso corporal será gravado para a perda de peso máximoe sacrificados. A decisão final de realizar a eutanásia é a critério do veterinário clínico e é tomada após consulta com o investigador principal.

3. Ensaio de placa para determinar o título de vírus em Pulmões com infecção aguda

  1. Títulos de infectividade do vírus são determinadas pela formação de placas em monocamadas de células Vero.
  2. As células Vero são semeados em 2.5x10 4 células / poço em placas de 12 poços na véspera do ensaio de placa. As células devem ser distribuídas uniformemente ea densidade celular deve chegar a 30-40% no dia do ensaio de placa.
  3. Prepare 0,5% (w / v) metilcelulose (MC) meio de cobertura (Tabela 1).
  4. Sacrifício γHV68 camundongos infectados 5-7 dias após a infecção intranasal para determinar os títulos de fase aguda do vírus nos pulmões. Para eutanásia Ketamine HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) será administrado IM seguido por overdose intravenosa de pentobarbital Na (30-50 IP mg / kg). Este método é aprovado pelo tele American Veterinary Medical Association.
  5. Colheita dos pulmões e enxaguar duas vezes com 1 x PBS para remover células do sangue. Coletar um lado do pulmão em 1 ml de meio DMEM gelada completa e manter em gelo. Rapidamente congelar o outro lado dos pulmões e armazenar a -80 ° C para o exame de DNA viral cargas nos pulmões por qPCR (veja abaixo).
  6. Use um homogeneizador de tecido para homogeneizar tecidos pulmonares em velocidade máxima por 1 segundo, congelar e descongelar-três vezes. Lave o homogeneizador com etanol 70% a cada passo quando se muda a amostra.
  7. Centrifugar os tecidos homogeneizados a 3.000 rpm por 10 min a 4 ° C. Coletar o sobrenadante e transferir para novos tubos de ensaio de placa.
  8. Prepare diluições em série (geralmente de 10 ° a 10 -8) das amostras de pulmão homogeneizado em 1,5 ml micro-centrífuga tubos com DMEM puro por vortex. Prefill o número apropriado de sondas com 540 mL DMEM e diluir 60 mL homogeneizado para o primeiro tubo. Transferir 60 mL do primeiro tubo inão um outro, e assim por diante.
  9. Aspirar a mídia da monocamadas preparado Vero nas placas de 12 poços e carga de 200 mL / homogeneizado bem serialmente diluída contendo vírus infeccioso em ordem inversa (de 10 ° -8 a 10). Use dois poços para cada titulação (em duplicado).
  10. Incubar as células Vero com o vírus inóculo 1 hora a 37 ° C. Agite suavemente as placas a cada 15 minutos para distribuir uniformemente o vírus sobre a monocamada.
  11. Remover o inóculo e substituí-lo com 2 ml / poço do meio de cobertura (Tabela 1). Incubar as placas por uma semana a 37 ° C.
  12. Remova o meio de overlay (não precisa ser completo) e substituir com a correção / médio mancha de ensaio de placa (Tabela 1) e incubar por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente.
  13. Quando as placas são secas, contar o número de bem-isolado placas em cada diluição. Para minimizar o erro, apenas os poços contendo entre 10 e 100 placas são contados.
  14. Calcule o título de vírus usando o seguinasa fórmula: título (UFP / ml) = [(número de placas / poço) / (volume de inóculo / poço)] x fator de diluição.

4. Ensaio Centro infecciosas para determinar a carga de vírus em esplenócitos latentes infectadas

  1. Carga viral latente é determinada pela infecciosas centro de ensaio (IC) sobre a monocamada de células Vero. Um dia antes do ensaio IC células, sementes Vero em 6-lamelas (1 -. 2,5 X 10 5 células / poço Normalmente, usamos 11 poços por amostra baço, 10 poços serão utilizados para a suspensão esplenócitos serialmente diluída e um poço para testes reativação espontânea do vírus após ciclos de congelamento e descongelamento.
  2. Sacrifício dos camundongos infectados após a latência é estabelecida (12-14 dias após a infecção). Colheita do baço de rato e piscina-los em 1 ml DMEM refrigerados.
  3. Dissociação mecânica do baço mouse. Transferir o baço de rato recém-isoladas em uma placa de 10 cm e adicionar 10 ml de meio DMEM desejado, como com 2% de SFB. Wet dois fosco-end de vidro Microscslides com ope gelada médio. Coloque o baço no lado fosco de um slide e nick da cápsula com a borda do fim do slide fosco outros. Mecanicamente dissociar o baço entre dois slides até que todos os aglomerados vermelho são esmagados (também remover partículas de gordura se houver).
  4. Lavar as lâminas com DMEM para recuperar as células restantes em ambos os slides.
  5. Transferir a suspensão de tecido toda suavemente através de um filtro celular (40 mesh nylon mm) em um tubo de 50 ml com tampa de rosca cônica. Lave o prato de 10 cm que contém o baço homogeneizados com 10 ml de PBS e transferir ao mesmo tempo de filtragem.
  6. Centrifugar a única célula suspensões 10 min a 375 xg e descartar o sobrenadante. Flick o pellets de células para quebrar aglomerados de células existentes. Adicionar 5 ml de tampão ACK (Tabela 1) para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar 5 min e centrifugar novamente a 375 x g.
  7. Desprezar o sobrenadante e re-suspender as pelotas, completamente, mas delicadamente, em PBS com 2% de SFB. Manter as células a 4 ° C. Use uma pipeta pararemover os resíduos, se houver. Contagem de células viáveis ​​utilizando um contador automático de células (Bio-Rad).
  8. Girar o esplenócitos PBS-ressuspenso em 375 xg durante 4 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em 4 ml DMEM completo (2 x 1 ml será usado para o ensaio IC da suspensão original; 0,6 ml utilizado para a diluição cinco vezes de série em ensaio de IC; 0,4 ml para a preparação de DNA viral e qPCR, e 1 ml de suspensão será usada para avaliar a reativação espontânea do vírus latente após três ciclos de congelamento e descongelamento)
  9. Prepare série de cinco diluições (ou seja, 05/01, 25/01, 1 / 125, 1 / 250) de esplenócitos suspensão em duplicatas. Prefill a 15 ml tubos cônicos com 2,4 ml DMEM e diluir 600 mL de suspensão esplenócitos para o primeiro tubo e misture bem. Transferência de 600 mL do tubo anterior no tubo seguinte, etc Não vortex!
  10. Aspirar o meio da monocamada 6-bem preparado de células Vero. Ml sementes 1 da série esplenócitos diluída em células Vero com cada diluição duplocupadas com (10 poços serão utilizados para 0, 05/01, 25/01, 1 / 125, 1 / 250 diluições).
  11. Incubar as placas em 12/08 horas a 37 ° C e 5% CO 2. Não excedam 24 horas. Aspirar o semeado suspensão esplenócitos e carga 4 ml de sobreposição de mídia (Tabela 1) a cada poço. Incubar por mais 6 dias.
  12. Determinar os níveis dos centros de baço infecciosas através da coloração das placas com 0,2% (w / v) violeta cristal como mostrado no ensaio de placa.

5. Quantificação do genoma viral

  1. Extrair DNA genômico total dos tecidos γHV68 infectados, como pulmão e baço amostras neste experimento. Use o Sangue Dneasy Kit & Tissue (Qiagen), seguindo protocolo do fabricante.
  2. Determinar a concentração de DNA de cada amostra para garantir a mesma quantidade de DNA a ser utilizado para o ensaio qPCR. Projetar o vírus primers específicos (~ 200 pb amplicon é o preferido para um ensaio de qPCR). Usamos o γHV68 ORF56 primers específicos (primer para a frente: 5 e prime; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; reverse primer: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') para este ensaio e β-actina primers (forward primer: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'reverse primer: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3'), como um controle para a reação qPCR.
  3. Misturar a amostra de DNA (100 - 500 ng é bom) e primers apropriados com 2 x SYBR mestre mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Use a Bio-Rad Real-Time PCR System para quantificar a carga viral nos tecidos infectados. Executar PCR na seguinte condição: 95 ° C por 15 min e 45 ciclos de 95 ° C por 30 min, 60 ° C por 30 min e 72 ° C por 30 min, seguido pela fusão análises curva, para ambos os vírus e amplicons de actina.
  4. Para fazer uma curva padrão para a quantificação de genomas virais, em série diluir quantidades conhecidas de um DNA γHV68 bacmid com o DNA genômico isolado a partir de células não infectadas. QPCR executar em paralelo com o DNAs obtidos a partir do infectecidos ted usando os mesmos conjuntos de vírus de primers específicos.
  5. Presente a carga genoma viral nos tecidos como o número de DNA viral cópia por unidade (por exemplo 100 ou 500 ng ng) de DNA genômico após a normalização de actina.

6. Resultados representativos:

A Figura 1 mostra o esquema geral dos experimentos para a medição de γHV68 infecção em camundongos in vivo. Resultados representativos dos títulos de vírus nos pulmões durante a infecção aguda de γHV68, conforme determinado pelo ensaio de placa, foram mostrados na Figura 2A. A cepa mutante de γHV68 contendo não-funcionais viral Bcl-2 (vBcl-2) replicadas em níveis comparáveis ​​aos do tipo selvagem γHV68 nos pulmões após 7 dias de infecção intranasal de camundongos BALB / c (6-7 ratos por grupo). Não houve diferenças estatisticamente significativas nos títulos de pulmão do vírus foram detectados entre os dois grupos. Estes dados indicam que vBcl-2 não é um fator crucial na infecção aguda da γHV68 emcamundongos. No entanto, até 28 de postinfection dias, o título de vBcl-2 vírus mutante na baços caiu 6 - a 10 - vezes em comparação com o WT, medida pelo ensaio de centro infecciosas (Figura 2B), sugerindo que a vBcl-2 mutante γHV68 vírus está com defeito na manutenção da latência do baço após a infecção. De acordo com a redução títulos centro infecciosas, a carga viral do genoma do vírus vBcl-2 mutante foi severamente reduzida comparada com a de vírus WT no dia 28 em experiências repetidas, como mostrado na Figura 2C. A estreita correlação entre as cargas genoma viral ea freqüência de latente-HV68vBcl-2 mutante vivo ex reativação do vírus na fase latente da infecção destaca um defeito de latência desta infecção pelo vírus mutante.

Figura 1
Figura 1. Diagrama esquemático para a medição de γHV68 infecção em camundongos por meio da formação de placas, centro infecciosas e ensaio qPCRs.

Figura 2
Figura 2. Líticas e infecção latente do WT e mutantes γHV68 vírus in vivo. Replicação aguda (A) do WT e vBcl-2 mutante γHV68 vírus nos pulmões dos ratos BALB / c em 7 dpi (infecção pós dia) foi determinada por ensaio de placa. (B e C) Esplênica centros infecciosas (B) e carga viral do genoma (C) no baço de camundongos infectados foram medidos em 28 dpi por ensaio centro infecciosas e qPCR, respectivamente. Linhas vermelhas, as médias dos valores indicados. ns, não significativo.

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Discussão

γHV68 tem sido amplamente utilizado como modelo para compreender a patogênese da humana γ-HVs 2,4,5. Neste protocolo, descrevemos três métodos rotineiramente usados, incluindo ensaio de placa para o título de vírus infecciosos, teste de IC para carga viral latente, e qPCR para carga genoma viral, para avaliar a infecção aguda e latente de γHV68 após a inoculação intranasal em camundongos.

O ensaio de placa tem sido amplamente utilizado para determinar o título de vírus em células ...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a assessoria técnica e apoio de Ren Sun (University of California, Los Angeles) e Hwang Seungmin (Washington University). Este trabalho foi financiado pela Fundação Baxter, National Institutes of Health subvenções (R01 e R21 CA140964 AI083841 para C. Liang).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do material Procedimento de preparação
Metilcelulose meio de cobertura (MC) para o ensaio de placa viral
  1. Calor ~ 250 ml de água destilada em frasco para TC> 80 ° C (a ferver durante 3 minutos no microondas)
  2. Adicionar gradualmente 2,5 g de pó MC em água aquecida, mexendo em fogo baixo até dissolver.
  3. Autoclave imediatamente por 15 min no ciclo de líquido.
  4. Agitando os meios de comunicação MC autoclavados a 4 ° C durante a noite.
  5. Combine 250 ml MC mídia com 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS dar 500 ml de mídia overlay.
Fix / mancha meio de ensaio de placa 0,2% (w / v) cristal violeta em etanol 20%.
Tampão de Lise ACK NH 4 Cl 0,15 M, KHCO 3 10mM, EDTA 0,1 mM
DMEM completo Meio modificado Dulbecco Águia(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamina, e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco-BRL).

Tabela 1. Mídias específicas utilizadas neste protocolo

Nome do reagente Companhia Número de catálogo
Ketamina Sigma-Aldrich K2753
Xilazina Sigma-Aldrich X1251
Metilcelulose Sigma-Aldrich M0512-250g
2 x MEM Life Technologies 11935
Coador celular BD Faclon 352340
Omni tecido homogeneizador OMNI Internacional TH115
Sangue Dneasy & Tissue Kit Qiagen 69504
iQTM SYBRH Verde Supermix BioRad 170-8882
CFX96 sistema em tempo real PCR Bio-Rad 184-5072
Contador de células Bio-Rad 145-0001
Sorvall SA-600 Thermo Scientific 096-124022

Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos

Referências

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