Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Resumo

Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.

Resumo

Nós desenvolvemos uma técnica BiFC para testar a interação entre duas proteínas in vivo. Isto é conseguido através da divisão de uma proteína fluorescente amarela (YFP) em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse. Estas construções podem ser co-Nicotiana benthamiana transformada em via Agrobacterium transformação mediada, permitindo a expressão de trânsito de proteínas de fusão. A reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito ^1-7. Para testar e validar as interações proteína-proteína, BiFC pode ser usado junto com o fermento dois híbridos do ensaio (Y2H). Isto pode detectar interações indiretas que podem ser negligenciados no Y2H. Tecnologia de gateway é uma plataforma universal que permite aos pesquisadores shuttle o gene de interesse (GOI) em como expressão e muitos sistemas de análise funcional como ^8,9 possível. Tanto a orientação do quadro de leitura e pode ser mantido sem o uso de enzimas de restrição ou ligadura de fazer-expressão pronto clones. Como resultado, pode-se eliminar todas as etapas de re-seqüenciamento para garantir resultados consistentes ao longo dos experimentos. Nós criamos uma série de vetores gateway compatível BiFC e Y2H que fornecer aos pesquisadores, com um fácil de usar ferramentas para executar ensaios tanto BiFC e Y2H ^10. Aqui, demonstramos a facilidade de usar o nosso sistema BiFC para testar interações proteína-proteína em N. plantas benthamiana.

Protocolo

1. Preparação da cultura de Agrobacterium

1. Agrobacterium cepa GV3101 previamente transformadas com a Gateway compatível BiFC vector pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-SN, cada um contendo uma fusão construção de GI.
2. Inocular a 5 ml YEB cultura (5g L extrato de carne ^-1, 1g L ^-1 extrato de levedura, 5g L ^-1 de peptona, 5g L ^{-1 de} sacarose, 2 mM MgSO _4, pH 7,2) de proteína de fusão BiFC construções transformou Agrobacterium com o seleção antibiótico adequado. Crescer a cultura durante a noite a 28 ° C agitação a 200 rpm.
3. Retire 1 ml da cultura em um tubo de centrifugação estéril de 1,5 ml.
4. Células de pelotas em 1000 g por 10 min em temperatura ambiente, elimine o sobrenadante.
5. Lave o pellet, adicionando 1 ml de mídia infiltração (5 g L ^-1 D-glicose, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na ₃ PO _4, 0,1 mM acetosyringone) ^11. Ressuspender pellet por pipetagem, as células pellet novamente em 1000 g por 10 min.
6. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes.
7. Ressuspender o sedimento em 0,5 ml de mídia infiltração.
8. Medir a absorvância a 600 nm e ajuste final de OD _600-1,0 para 1,2.
9. Alíquota de uma quantidade igual de suspensão de Agrobacterium de cada construção em um tubo ml novo 1.5, vortex por 10 seg. Para uma infiltração única, de 100 L de cada construção é mais do que suficiente.
10. A mistura Agrobacterium está agora pronto para a infiltração.

2. Infiltração

11. N. benthamiana plantas são cultivadas a 21 ° C, com 16 h de luz e 8 h-ciclos escuros. Cinco para as plantas de seis semanas de idade devem ser usadas para a infiltração.
12. Remover as plantas da sala de crescimento e colocar sob a luz branca para 1 h antes infiltratring permitindo que os estômatos de abrir totalmente.
13. Elaborar mistura Agrobacterium ressuspendidos em 1 ml seringa de deslizamento de ponta sem a agulha.
14. Coloque a ponta da seringa contra a parte inferior da folha e suavemente o êmbolo, enquanto apoiando diretamente a parte superior da folha com um dedo. O líquido se difunde através da folha, uma vez que preenche os espaços de ar mesophyllar.
15. Rótulo da área infiltrada com uma caneta marcador para identificação futura.
16. Quando se infiltrar com construções diferentes, certifique-se que quer mudar suas luvas ou limpá-las com álcool a 70% entre infiltrações. Se possível, deixe um espaço nervura central entre as amostras diferentes para evitar a contaminação cruzada.
17. Coloque plantas em uma câmara de crescimento sob condições de crescimento normal.

3. Observação do sinal YFP reconstituído

18. Consumo de um segmento x 5mm 5mm de tecido foliar no interior da zona infiltrada
19. Montagem da amostra, em água, em uma lâmina de vidro, cubra a amostra com uma lamínula e examinar as interações usando um microscópio confocal ou fluorescência.
20. Expressão deve ser monitorada a cada 24 horas desde o momento da infiltração de até 5 dias mais tarde, como sobre a expressão / tráfico pode resultar em proteínas de fusão fluorescentes exibindo vários locais diferentes ao longo de um curso de tempo.

4. Resultados representativos:

Um exemplo de interação proteína-proteína testada por ensaio BiFC é mostrado na Figura 1. AtTHP1 e AtSAC3A Acredita-se que os componentes da Arabidopsis homólogo de levedura TREX-2 complexos. Eles podem interagir com um AtNUP1 nuclearporin e facilitar a exportação de mRNA ^10. AtTHP1 e AtSAC3A foram clonados em pEarlyGate201-YC enquanto AtNUP1 foi clonado em pEarlyGate202-SN. Os construtos foram posteriormente transformadas em GV3101. As três construções foram pareados com 3 combinações possíveis (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) para infiltração. O sinal YFP reconstituído foi observado sob uma LCSM 48 horas após a infiltração. Os sinais foram observados nas células epidérmicas e localizadas na periferia nuclear ou plasma nuclear, o que é consistente com a localização sub-celular destas proteínas. Os controles negativos não mostraram qualquer sinal YFP.

Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componentes mRNA exportação complexo interagem uns com os outros. N. benthamiana folhas, co-transformada com construções de GOI fundido a pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-SN (como indicado), foram fotografadas 48-72 h após a infiltração, usando um microscópio Leica TCS SP2 confocol. Imagens são mostradas como YFP confocal fundidas e brilhantes de campo imagens da epiderme N. células benthamiana folha

Discussão

Ensaio BiFC é uma ferramenta poderosa para estudar interações protéicas. Ao contrário do ensaio Y2H tradicional, BiFC não só permite a visualização de interações proteína-proteína, mas também fornece mais informações do complexo de proteínas, como sub-celular de localização. Além disso, é possível detectar interações indiretas, desde que as duas proteínas candidato pode ser trazido perto o suficiente por um terceiro parceiro. Como qualquer tecnologia, BiFC tem suas limitações. Devido a necessidade de oxigênio molecular ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406
MES hidrato	Sigma-Aldrich	M2933
1 mL seringa de tuberculina de ponta deslizante	BD Biosciences	309602