Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Resumo

Identificação imunocitoquímica de periféricos subtipos de fibras nervosas sensoriais (e detecção da expressão da proteína nele) são fundamentais para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a sensação periférica. Aqui descrevemos métodos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral, tais como ossos, pele e nos membros, para a imunocoloração específico de fibras nervosas sensoriais periféricas.

Resumo

Detecção e processamento primário de física, química e térmica por estímulos sensoriais periféricos fibras nervosas sensoriais é fundamental para a percepção sensorial em animais e humanos. Essas fibras nervosas sensoriais periféricas expressam um grande número de receptores e proteínas de canais iônicos que detectam e iniciar específicos estímulos sensoriais. Métodos estão disponíveis para caracterizar as propriedades elétricas do periférico as fibras nervosas sensoriais que inervam a pele, que também pode ser utilizado para identificar a expressão funcional de proteínas canal específico de íons nessas fibras. No entanto, similar métodos eletrofisiológicos não estão disponíveis (e também são difíceis de desenvolver) para a detecção da expressão funcional de receptores e proteínas de canais iônicos na periferia fibras nervosas sensoriais que inervam outros órgãos viscerais, incluindo os tecidos mais difíceis como o osso. Além disso, tais métodos eletrofisiológicos não pode ser utilizado para determinar a expressão de proteínas não-excitáveiss em fibras nervosas sensoriais periféricas. Portanto, imunocoloração de amostras de tecido periférico / visceral para Fivers nervosas sensoriais fornece a melhor maneira possível para determinar a expressão de proteínas específicas de interesse nestas fibras nervosas. Até agora, a maioria dos estudos de proteínas expressão em neurônios sensoriais têm utilizado imunocoloração procedimentos em gânglios sensoriais, onde a informação é limitada à expressão de proteínas específicas no corpo da célula de tipos específicos ou subconjuntos de neurônios sensoriais. Aqui relatamos métodos detalhados / protocolos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Nós métodos especificamente detalhe para a preparação da pele ou biópsia plantar e osso (fêmur) seções de camundongos para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Estes métodos não são apenas a chave para a determinação qualitativa de expressão de proteínas em neurônios sensoriais periféricos, mas também fornecem um método quantitativo para ensaiodeterminar alterações nos níveis de proteína expressão em tipos específicos ou subconjuntos de fibras sensoriais, bem como para determinar as mudanças morfológicas e / ou anatômica no número e densidade de fibras sensoriais durante vários estados patológicos. Além disso, estes métodos não estão confinados à coloração de apenas fibras nervosas sensoriais, mas também pode ser usado para a coloração de todos os tipos de fibras nervosas na pele, ossos e tecido visceral outros.

Protocolo

1. Perfusão animais

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo são aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade de Iowa, e seguir as orientações do NIH para o uso de animais em pesquisa.

1. No dia antes da perfusão, preparar 1 L de tampão fosfato (0,2 M PB em dobro destilada H ₂ O, pH 7,4), e armazenar a 4 ° C. Isso será usado para os processos de perfusão e pós-fixação.
2. No dia da perfusão, preparar 500 ml de paraformaldeído 4,0% em 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) solução fixadora, um volume suficiente para a perfusão de 2 ratos: microondas de 200 ml de DDH ₂ O em ....

Discussão

Aqui temos detalhados os métodos para a preparação da pele do rato e seções de tecido ósseo para a imunocoloração e detecção de periféricos fibras nervosas sensoriais. As seções produzido a partir de biópsias plantar soco conter a pele glabra e cabeludo, o que significa que o protocolo pode ser usado em qualquer tipo de pele. Essas técnicas também podem ser empregadas para corar outros tipos de células nesses tecidos (por exemplo leucócitos, endotélio vascular, músculo liso entre outros). Esses métodos fornecem um excel.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do material	Tipo	Companhia	No. de catálogo	Comentário
Harris 3 milímetros Micro-Punch	Material	Ted Pella	15094
Bomba de perfusão	Material	VWR International	23609-170
Paraformaldeído	Reagente	Fisher Scientific	T353
Ácido pícrico	Reagente	Sigma-Aldrich	239801
Outubro composto Embedding	Reagente	Tissue-Tek	4583
Cito-Freeze criogênicos aerossol	Material	Empresa de controle	3118
O soro de cabra	Reagente	Sigma-Aldrich	G9023
Bandeja de incubação e tampa para imunocoloração (Large)	Material	RPI Corp	248270 (bandeja) 248270-A (tampa)
ImmEdge caneta barreira hidrofóbica	Material	Vector Laboratories	H-4000
Camelo escovas de cabelo (# espessura 1)	Material	Ted Pella	11859
Pro-Long Ouro de montagem médio	Reagente	Invitrogen	P36930