Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.
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Artigo de método
Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estresse oxidativo tem sido implicado em uma série de condições patológicas, incluindo isquemia / reperfusão e sepse danos. O conceito de estresse oxidativo refere-se a formação aberrante de ROS (espécies reativas de oxigênio), que incluem O 2 • -, H 2 O 2, e radicais hidroxila. Espécies reativas de oxigênio influencia uma grande variedade de processos celulares, incluindo transdução de sinal, a proliferação celular e morte celular 1-6. ROS têm o potencial de dano vascular e células de órgãos diretamente, e pode iniciar reações químicas secundárias e alterações genéticas que acabará por resultar em uma ampliação do dano tecidual inicial ROS-mediada. Um componente-chave da cascata de amplificação que agrava prejuízos irreversíveis é o recrutamento e ativação de células inflamatórias circulantes. Durante a inflamação, as células inflamatórias produzem citocinas como fator de necrose tumoral α (TNF) e IL-1, queativam as células endoteliais (CE) e células epiteliais e aumentar ainda mais os 7 resposta inflamatória. Disfunção endotelial vascular é uma característica estabelecida de inflamação aguda. Macrófagos contribuir para a disfunção endotelial durante a inflamação por mecanismos que permanecem obscuros. Ativação de macrófagos resulta na liberação extracelular de O 2 • - e várias citocinas pró-inflamatórias, o que desencadeia a sinalização patológicos nas células adjacentes 8. Oxidases NADPH são a principal fonte primária de ROS e na maioria dos tipos de células. Recentemente, ele é mostrado por nós e outros 9,10 que ROS produzidos por oxidases NADPH induzir a produção de ROS mitocondrial durante muitas condições fisiopatológicas. Daí a medição da produção de ROS mitocondrial é igualmente importante, além de medir citosólica ROS. Macrófagos produzem ROS pela oxidase NADPH flavoproteína enzima que desempenha um papel fundamental na inflamação. Uma vez ativado,NADPH oxidase fagocítica produz grandes quantidades de O 2 • - que são importantes no mecanismo de defesa hospedeiro 11,12. Embora parácrinos derivados de O 2 • - desempenha um papel importante na patogênese de doenças vasculares, visualização de parácrina ROS induzida pela sinalização intracelular, incluindo Ca 2 + mobilização ainda é hipótese. Nós desenvolvemos um modelo em que macrófagos ativados são usados como uma fonte de O 2 • - para transdução do sinal para as células endoteliais adjacentes. Usando esse modelo, demonstramos que macrófagos derivados de O 2 • - levar ao cálcio sinalização em células endoteliais adjacentes.
Protocolo
Espécies reativas de oxigênio pode ser medido em células vivas usando corantes de oxidação sensíveis (1 e 2) ou usando sensores de plasmídeo (3 e 4) por microscopia confocal.
1. Visualização de citosólica ROS em células J774
- Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 6 células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h.
- Células desafio com agonistas TLR (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C) TLR3-agonista, 1 mg / ml LPS-agonista TLR4) por 6 horas a 37 ° C.
Nota: Os macrófagos tratados em condições semelhantes foram utilizados par....
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Discussão
O método descrito aqui permite a medição rápida e quantitativa de espécies reativas de oxigênio em células vivas ou usando corantes de oxidação ou sensores sensíveis plasmídeo. Agonistas de TLRs (Toll-like receptors) são compostos que estimulam as células através dos TLRs presentes na superfície das células e acionar as vias de sinalização a jusante 15. Em nosso protocolo, usamos três diferentes TLR viz agonistas, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; Poly (I: C). TLR3-agonista; LPS-TLR4 agonista que são relatad.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde de subvenção (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Nosso artigo é parcialmente suportado pelo Carl Zeiss microfilmagem LLC.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Attofluor câmara de celular | Invitrogen | A7816 | |
| A Antimicina | Sigma Aldrich | A8674 | |
| DMEM baixa glicose | Invitrogen | 10567-014 | |
| Suplemento de fator de crescimento endotelial (ECGS) | Norte do estado | 02-102 | |
| Soro fetal bovino | Invitrogen | 12662011 | |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gelatina | Sigma Aldrich | G1393 | |
| H 2 DCFDA | Invitrogen | D-399 | |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 | |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Opti-MEM eu Redução Médio de soro | Invitrogen | 51985091 | |
| Pen / Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 | |
| pHyPer-cito | Evrogen | FP941 | |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 | |
| Poli (I: C) | Sigma Aldrich | P0913 | |
| Prism software 5,0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| SigmaPlot 11,0 | Systat software, Inc. | ||
| Tripsina-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 | |
| T-25 Frascos | Corning | 430639 | |
| T-75 Frascos | BD Falcon | 353136 | |
| 96-T bemC micro placa bem | BD Falcon | 353072 | |
| Zen software 2009 | Carl Zeiss 510 microscopia confocal Meta |
Referências
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Re....
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Reimpressões e permissões
