Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

Resumo

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

Resumo

A geração e detecção de forças mecânicas é um aspecto onipresente de fisiologia celular, com relevância direta para câncer de metástase ^{1, 2} e aterogênese cicatrização ^3. Em cada um destes exemplos, as células tanto exercer força sobre os seus arredores e, simultaneamente, remodelação enzimaticamente a matriz extracelular (ECM). O efeito das forças sobre ECM tornou-se assim uma área de grande interesse devido à sua provável importância biológica e médica ^4-7.

Técnicas única molécula, como a captura óptica ^8, microscopia de força atômica ^9, e pinças magnéticas ^10,11 permitir aos pesquisadores sondar a função de enzimas em um nível molecular, exercendo forças em proteínas individuais. Destas técnicas, pinças magnéticas (MT) são notáveis ​​pelo seu baixo custo e alto rendimento. MT exercem forças na gama de 1-100 ~ pN e pode fornecer milissegundo resolução temporal,qualidades que são bem adaptado para o estudo do mecanismo de enzima no nível molécula única ^12. Relatamos aqui um ensaio de MT altamente paralelizável para estudar o efeito da força sobre a proteólise das moléculas de proteína única. Apresentamos o exemplo específico da proteólise de um péptido de colagénio trimérico por metaloproteinase de matriz 1 (MMP-1), no entanto, este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outros substratos e proteases.

Protocolo

1. Preparação célula de fluxo

1. Lamelas (# 1.5, 22x22 mm e 22x40, VWR) são limpos usando sonicação.
   1. Adicionar as lamelas de um pequeno recipiente de vidro capaz de manter lamelas e encaixando no sonicador (ver passo 2).
   2. Encher o recipiente com isopropanol e sonicar num sonicador de banho durante 20 minutos.
   3. Descartar o isopropanol e enxaguar as lamelas com quantidades copiosas de água desionizada produzido por um aparelho de MilliQ Barnsted ou dispositivo semelhante. Encher o recipiente com água e sonicar durante 20 minutos.
   4. Após sonicação, secar as lamelas em uma corrente de filtrado, o ar livre de poeira. Use apenas lamelas que aparecem limpos (sem manchas).
   5. Gentilmente chama as lamelas por alguns segundos para limpá-los de qualquer poeira restante, e umidade: passar as lamelas através de uma chama de gás produzido com um bico de Bunsen, tomando cuidado para não deformar a lamela devido ao excesso de calor. Este passo remove superfície residualcontaminantes.
2. Usando dupla face fita adesiva, prenda as duas lamelas juntos. Cortar a fita ~ 3 cm de comprimento e 0,3 cm de largura. Coloque a fita sobre lamínula 22x40 milímetros deixando um canal de 1,6 centímetros no meio. Usar uma ponta de pipeta suavemente para pressionar para baixo sobre a lamela para assegurar que a fita tem adequadamente aderido.

2. Configuração Pinças magnética e Calibração

1. Pinças magnéticas foram configurados usando permanentes de terras raras ímãs, como descrito anteriormente ^10,12. Um alumínio suporte em L foi construído com um furo de diâmetro 1 mm e montado sobre uma vertical z-tradutor (Thorlabs) para modular a altura da pinça. Dois permanentes de terras raras ímans foram ligados ao suporte em ambos os lados do orifício para criar a armadilha magnética (Figura 1).
2. Preparação de ADN: DNA de fago lambda rotulado a sua 5 'e 3' termina com biotina e digoxigenina (IDT DNA, San Diego, CA) foi utilizado para calibrar o magpinças magnéticos.
   1. Misturar 50 uL de 4 nM λ-DNA com 2 ul de 40 nM de biotina conjugado oligonucleótido e aquecer a 60 ° C durante 10 minutos. Em seguida, arrefecer lentamente à temperatura ambiente durante 1 hora.
   2. Adicionar ligase de DNA de acordo com as especificações do fabricante e ligar à temperatura ambiente durante 3 horas.
   3. Adicionar 2 uL de 400 nM oligonucleótido digoxigenina conjugado e incube à temperatura ambiente durante 45 minutos.
   4. Adicionar 1,5 uL de 10 mM ATP e continuar a ligadura do oligonucleótido digoxigenina conjugado com o λ-DNA durante 3 horas.
   5. Remover os oligonucleótidos em excesso eo usando DNA-ligase de 100 kDa filtros de spin (Microcon Ultracell YM-100). Um total de 1000 vezes troca de tampão em tampão TE é adequado para eliminar os oligos em excesso. Nota: É importante não utilizar velocidades de rotação> 500xG porque irá conduzir à ruptura do ADN.
   6. Examinar uma amostra do ADN através de electroforese num gel de agarose a 0,7% para assegurar que o DNA inão é desnaturado ou cortado.
   7. Medir a concentração de DNA. A utilização de um espectrómetro de UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific) é recomendado porque o volume de amostra disponível pode ser muito pequena.
3. Prepare-se células de fluxo, tal como descrito na seção 1.
4. Para a fixação do DNA para a célula de fluxo, adicionar o anticorpo anti-digoxigenina (ovinos IgG; 1 ug mL ^-1; Roche Bioscience, Manheim, Alemanha) e permitir que ele adere à superfície do vidro durante 15 minutos.
5. Passivar a superfície da célula de fluxo para evitar colagem não-específica do DNA por adição de 2 mg mL ^-1 de BSA, 0,1% de Tween-20 em 1x PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos.
6. Repita o passo 2.5.
7. Adicionar 50 pM de fuctionalized λ-DNA e permitir que a associar à lamela durante 15 minutos.
8. Lava-DNA em excesso com 1x PBS.
9. Adicionar grânulos revestidos estreptavidina-superparamagnéticas (1 grânulos iM = 2 ug mL ^-1, 2,8 grânulos iM = 20 ug mL ^-1
10. Lavar o excesso de grânulos com 1x PBS.
11. Calibração Pinça Magnética
    1. Mova os ímãs permanentes para uma posição que está longe da superfície da amostra (> 15 mm).
    2. Coloque a célula de fluxo preparado no microscópio.
    3. Mova os ímãs permanentes para a posição acima da célula de fluxo.
    4. Escolha o plano focal da λ-DNA contas funcionalizados, concentrando-se nas contas de distância de ambas as superfícies de vidro. O plano focal correcta é aquele em que os grânulos têm um centro desejados brilhante.
    5. Faça um vídeo de movimento talão de 80 Hz ou superior a 500 frames.
    6. Mova o íman mais perto da superfície da amostra. Para distâncias superiores a 5 mm, se mover em incrementos de 1 mm. Para distâncias entre 1 mm e 5, mover-se em incrementos de 0,5 mm. Para distâncias inferiores a 1 mm, mover-se em incrementos de 0,25 mm.
    7. Repita os passos 2.11.5 e 2.11.6 em cada posição novo ímã.
    8. Para cada dadodefinido, controlar o centro dos grânulos utilizando um ajuste gaussiano 2D.
    9. Calcule a força através de flutuações browniano por meio de:

    
    onde k _B T é a energia térmica Boltzmann, L é o comprimento de λ-DNA, e 2> é a variância na posição centróide.

    10. Confirmar a exatidão das forças verificando o cálculo da força através de um ajuste de energia do espectro Lorentzian a fim de encontrar a freqüência rolloff. Força aplicada é relacionada com a frequência rolloff pela relação:

    
    Onde ₀ f é a frequência rolloff, a é o raio do grânulo, e μ é a viscosidade do fluido ^12.

3. Collagen Peptide anexo para as células de fluxo

A fim de proporcionar um exemplo concreto para a aplicação da nossa metodologia, descrevemos trabalho recente no nosso laboratório, que caracteriza a proteólise de um péptido trimérico colagénio modelo. Prevemos que esta abordagem geral pode ser amplamente aplicado a outras proteínas e polinucleótidos.

1. O péptido modelo de colagénio consiste de um N-terminal His-6x para a purificação, seguido por uma etiqueta de 5x myc, (GPP) ₁₀ para aplicar a formação de hélice tripla, o colagénio a1 resíduos 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), que formam a MMP- 1 local de reconhecimento, a sequência de foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), e uma KKCK C-terminal para facilitar a marcação com biotina-maleimida. Foldon deriva do fibritin proteína T4-fago, e estabiliza trímeros modelo de colagénio quando fundido em uma ou outra a N - ou C-terminal ^13,14.
2. O péptido de colagénio e MMP-1 proteínas foram expressas e purificada como descrito anteriormente ^4,15.
3. Adicionar anti-myc (15 ug ml ^-1) para a célula de fluxo e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que o anti-myc para anexar à superfície da célula de fluxo.
4. Passivar a célula de fluxo para evitar ligação não específica de proteínas utilizando 5 mg mL ^-1 BSA da mesma forma como descrito no passo 2.5.
5. Adicionar 150 pM péptido de colagénio e permitir que ele para anexar o anticorpo através da marca de myc durante 45 minutos.
6. Lave o colágeno em excesso com tampão PBS.
7. Adicionar contas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina (1 contas mM = 2 mg mL ^-1 e 2,8 mM contas = 20 mg mL ^-1) e permitir que eles atribuem às moléculas de colágeno por 45 minutos. As pérolas de 1 uM deve ser diluído até à concentração desejada em PBS. As pérolas de 3 uM deve ser separado da solução usando ímans fortes, em seguida, resolubilized em PBS. Este processo deve ser repetido 3 vezes. Percebemos que este passo é essencial para a get as pérolas de 3 uM de se ligar a superfície imobilizada péptido de colagénio.

4. Ensaio Proteólise Força

1. Uma vez que a célula de fluxo é montado com o péptido de colagénio e as esferas magnéticas, a imagem da célula de fluxo na armadilha magnético sob baixa, ~ força pN 1. Na nossa experiência, uma subpopulação das pérolas é por vezes fracamente aderida à superfície de uma forma não específica. A aplicação de força modesto assegura que estas pérolas são libertados.
2. Adicionar enzima activada para a célula de fluxo. Neste caso a MMP-1 foi pré-activado por adição de 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubados a 37 ° C durante 3 horas. A ativação foi verificada utilizando SDS-PAGE.
3. Logo que a célula de fluxo é re-introduzido no aparelho pinças magnético, gravar um vídeo spanning alguns campos de visão, tipicamente rendendo várias centenas de pérolas anexas. Este será t = 0.
4. Repita o mesmo processo de gravação de vários campos de vista (quando regressava to o mesmo campo de visão) em pontos regulares de tempo, até que todas as esferas de separar ou não proteólise ainda é perceptível.
5. A análise dos dados cinéticos
   1. Conte com as contas em vários campos de vista em diferentes momentos e média-los. Normalizar o número de esferas, dividindo o número médio de grânulos em cada ponto de tempo pelo número de pérolas em t = 0. Isso garante que podemos comparar as taxas de proteólise de experiências diferentes, porque o número absoluto de contas será diferente de experimento para experimento.
   2. Traça-se a razão como uma função do tempo. Neste caso, equipado-lo para um decaimento exponencial mais uma constante.

   
   onde f (t) é a razão entre as esferas associadas (ou moléculas de colagénio unproteolyzed), t é o tempo, uma é a fracção de grânulos ligados por um tirante de colagénio, b é a taxa de decaimento constante, e cé a fracção de grânulos que estão ligados não especificamente.

   3. A mesma experiência é repetida em diferentes força e MMP-1 concentrações para elucidar o efeito da força sobre a proteólise de colagénio por MMP-1.

5. Os resultados representativos

O protocolo acima descreve uma nova utilização de uma pinça magnética (Figura 1) para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática. Nós calibrado as pinças para 1 mícron e 3 uM grânulos utilizando tanto a magnitude das oscilações observadas brownianos e cálculo da frequência roll-off em posições diferentes de íman (Figura 2). Nas experiências de proteólise de força, a configuração é semelhante, excepto que o ADN é substituído com colagénio (Figuras 3, 4). O número normalizado de pérolas restantes podem ser traçados em função do tempo para encontrar as taxas de proteólise (Figura 5), e este processo pode serrepetido para várias concentrações de enzimas e de forças.

Figura 1. Esquemática do processo magnético armadilha de calibração (não à escala). Dois permanentes imans de terras raras criar um campo magnético que puxa a superparamagnético grânulo. Traduzir o íman cima e para baixo ajusta a força aplicada. As contas são fotografada utilizando um microscópio de campo brilhante convencional com a luz que passa através de um orifício entre os dois imans Inset:. Imagem tirada com um objectivo de ar de 40x. Os afiadas, pontos redondos correspondem aos grânulos que aderem à superfície lamela. Os objetos fora de foco são esferas separadas.

Figura 2. A representação gráfica da força calibrado como uma função da distância a partir do magneto superfície da amostra durante 1 mM (esquerda) e 2,8 mM (direita) do grânulos. Os dados estavam aptos para a função empírica , Onde x é a distância entre o íman. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 para os grânulos de 1 pm e uma = 140, b = 3,10 e c = 1,86 para os 3 grânulos uM. Estes valores são específicos para o nosso instrumento específico e geometria experimental, e cada instrumento deve ser calibrado individualmente. As barras de erro em cada ponto representa uma variabilidade ~ 10% em força aplicada sobre um grânulo de base do grânulo, devido à variabilidade no tamanho do grânulo. A força aplicada é proporcional ao volume dos grânulos, e que o volume do grânulo varia ~ 9% sobre a média (de acordo com as especificações do fabricante).

Figura 3. Força configuração ensaio proteólise (não à escala). O trímero modelo de colagénio está ligado à superfície do lamela via myc / anti-myc conjugação. As pérolas revestidas de estreptavidina-superparamagnéticas estão ligados a os trímeros de colagénio através de uma ligação biotina-estreptavidina. Activada MMP-1 cortes do colagénio ao longo do tempo, causando as pérolas para separar a partir da superfície e afastar-se do plano focal.

Figura 4. Dos desenhos esquemático de proteólise como uma função do tempo. O desenho mostra um campo de vista da amostra ao longo do tempo como proteólise ocorre. Ao longo do tempo, a MMP-1 cortes o colagénio e as contas de vidro separar e afastar-se do plano focal sob a influência do campo magnético.

As taxas de proteólise Figura 5. Dependem força aplicada ^16. São mostrados os dados coligidos a 1,0 pN (3 uM MMP-1; preto), 6,2 pN (3 uM MMP-1; vermelho) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magonta). As taxas de proteólise (parâmetros de ajuste) são: 0,22 ± 0,02 min ^-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min ^-1 (6,2 pN), e 2,08 ± 0,18 min ^-1 (13 pN). A fracção de grânulos unproteolyzed em pontos de tempo longo (> 15 minutos) permanece aproximadamente constante em toda a ~ 0,25 experiências diferentes. As barras de erro correspondem ao estatísticas Poisson reflectindo o número de observações em cada ponto de tempo. O erro em cada ponto de tempo para as esferas n é n ^1/2. O erro na fracção de grânulos ligados foi calculada por erro propagation.1 grânulos mM foram usados ​​para 1,0 pN e experiências 6.2 pN e 2,8 uM grânulos foram utilizados para experiências de 13 pN.

Discussão

Este protocolo descreve uma nova utilização para uma técnica clássica molécula única. Pinças magnéticas permitir médio e alto rendimento ensaios única molécula de uma forma custo-eficiente. No entanto, como todas as técnicas experimentais que existem desafios e armadilhas potenciais.

Limitações de pinças magnéticas

Em comparação com uma armadilha óptica a resolução espacial e temporal de um aparelho de MT é baixa. Além disso, as forças geradas pelo MT simples aqui d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do Reagente	Companhia	Número de Catálogo
Micro tampa de vidro # 1.5 (22x22)	VWR	48366-067
Micro tampa de vidro # 1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda DNA	Invitrogen	25250-010
DNA-ligase de T4	Invitrogen	15224-041
Microcon Ultracel YM-100	Millipore	42413
Anti-digoxigenina	Roche Diagnostics	11-333-089-001
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Anti-myc Anticorpo	Invitrogen	46-0603
Albumina de Soro Bovino	Sigma	B4287-5G
Dynabeads M-280 Estreptavidina	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 Estreptavidina	Invitrogen	658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetato	Calbiochem	164610
Biotina-maleimida	Sigma Aldrich	B1267
Marcado com biotina oligo	IDT DNA	Síntese feita sob encomenda
Digoxigenina marcada oligo	IDT DNA	Síntese feita sob encomenda
Colágenogene peptídeo	DNA 2.0	Síntese feita sob encomenda
MMP-1 ADNc	Harvard Banco de Dados Plasmid
z-tradutor	Thorlabs	MTS50
Controlador de Servo para tradutor	Thorlabs	TDC001