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1. Semeadura das células
- Antes de começar, aqueça o meio de cultura, a PBS 1X e da tripsina em banho-maria a 37 ˚ C
- Tome as células fora da incubadora e aspirar o médio.
- Aplicar suavemente 5 mL de PBS 1X sobre as células de lavá-las.
- Aspirar o PBS 1X e aplicar 1 mL de tripsina contendo 0,025% EDTA.
- Gire gentilmente a placa para ter uma distribuição uniforme da tripsina.
- Coloque as células na incubadora a 37 ˚ C por 5-10 minutos (dependendo do tipo de célula). De tempos para verificar o tempo se as células são separadas por agitação da placa.
- Ressuspender as células em 10-20 mL de meio e recolhê-las em um tubo falcon 50 mL.
- Contar as células utilizando um contador Beckman. O número de células deve ser suficiente para garantir uma confluência de aproximadamente 60-70%.
- Placa das células e permitir-lhes sementes de 6-8 horas.
2. Transfection
- Antes de transfecção, aquecer uma alíquota de soro livre médio em banho-maria a 37 ˚ C.
- Trazer o Gene X-treme 9 a temperatura ambiente.
- Pipeta o meio isento de soro em dois tubos de eppendorf (1 tubo de transfecção = 1).
- Pipeta o Gene X-treme 9 na atenção meio isento de soro pagar que a ponta não toca a parede de plástico do eppendorf e incubar por 5 minutos. Nesse meio tempo preparar duas mixagens DNA: em um tubo de misturar os plasmídeos para renilla, vagalume e um controle do vetor vazio, em outro renilla tubo, firefly ea acompanhante molecular.
- Adicione a mistura de DNA de cada eppendorf contendo meio livre de soro + X-treme Gene 9, vortex e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
- Adicionar gota a gota cada mistura em cada placa e incubar por 24 horas a 37 ° C e CO 2 5%
3. Divisão das células
- 24 horas após a transfecção, trypsinize as células como descrito em 1,4-1,6 e diluí-los a uma confluência final de 60-70% em uma placa de 6 poços.
- Prepare um prato para o controle não-chocado e como muitos pratos como os pontos de tempo de recuperação que têm de ser analisados, como mostrado na figura. 2.
4. Choque térmico
- Para choque de calor, pré-aquecido soro contendo meio em banho-maria a 37 ˚ C.
- 'Buffer de choque térmico "preparar diluindo em meio cicloheximida soro contendo uma concentração final de 20 mcg / ml e MOPS a 20 mM.
- Agora tire as placas da incubadora e aspire o meio.
- Adicionar a cada 1 mL de bem 'buffer de choque de calor ", e incubar por 30 minutos a 37 ˚ C e 5% de CO 2 (incluem também a placa de referência neste tratamento). Isto irá parar de novo a síntese de proteínas.
- Enquanto isso no interruptor em um banho de água e definir o temperatura de 45 ˚ C.
- Após a incubação, a tampa de vedação das placas com Parafilm previamente cortados em tiras. A placa de referência (100% de refolfed vagalume) fica na incubadora.
- Incubar as placas a 45 ˚ C durante 30 minutos.
- Remova as placas do banho-maria, retire o parafilme e colocar as placas de volta para a incubadora para permitir a recuperação.
- Em cada ponto de colheita o tempo as células e lavá-los em PBS 1X por centrifugação em 2000Xg por 1 minuto a 4 ˚ C.
5. Lise celular e ensaio de luciferase
- Para uma lise celular eficiente, snap congelar o pellet celular em nitrogênio líquido.
- Adicionar 200 mL de tampão de lise passiva diluído 1:5 em água destilada duas vezes em um tubo de vidro.
- Adicionar 30 mL do lisado de células em uma placa de 96 também. Cada amostra é pipetados em triplicata.
- Apenas o "não chocado" amostras de referência será utilizado paraler a atividade renilla luciferase, uma vez que esta etapa é utilizado para verificar a eficiência de transfecção iguais.
- Preparar as soluções para o ensaio. Para a solução de luciferina luciferina diluir para uma concentração final de 0,2 mM em Gly-Gly buffer. Para o tampão de reação diluir TDT e ATP a concentração final 1mM em Gly-Gly buffer. Para tampão de reação celenterazina, diluir celenterazina para uma concentração final de 0,2 mM em tampão celenterazina. Mantenha solução luciferina e celenterazina luz tampão de reação protegida.
- Agora coloque a placa de 96 poços na luminómetro e iniciar o programa 'Wallac 1420 Workstation.
- Introduzir o Pump1 no tubo falcon contendo a solução celenterazina. Feche a tampa para que a luz não pode entrar em contato com o tubo.
- Escolha no menu 'manutenção Dispenser' a opção e marque Pump1.
- Selecione a opção "Fill".
- Para editar o layout da placa escolha a opção "Explorar protocolo e resultados" no menu. Selecione o protocolo e clique duas vezes sobre ele. Agora selecione os poços a serem lidos.
- Voltar ao 'Wallac Manager' e clique em "Iniciar". A reação entre o luciferase renilla e seu substrato celenterazina emite luz com um comprimento de onda de 482 nm.
- Após a leitura, vá em "manutenção Dispenser 'e selecione' Vazio 'e Pump1 para liberar toda a solução residual de volta para o tubo.
- Agora mova o tubo para um tubo falcon contendo água e marque a opção 'flush'.
- Após a etapa de lavagem, esvaziar o tubo por selecionar 'vazio'.
- Colocar o tubo de Pump1 no tubo do tampão de reação falcon e um da Pump2 no tubo falcon luciferina.
- Alterar o layout da placa.
- Selecione 'Preencher' para Pump1 e Pump2 da Di 'menu de Spenser Manutenção '.
- Selecione o protocolo e iniciar a leitura. A reação entre o Firefly luciferase e luciferina seu substrato emite luz com um comprimento de onda de 560 nm.
- No final da leitura repita o procedimento Vazio-Flush-vazio para Pump1 e Pump2.
- Resultados já estão disponíveis no 'Wallac 1420 Explorer'.
- Cada experimento é associado a um número ensaio, nome de usuário, data de início e fim.
- Resultados podem ser exportados como um arquivo de Excel.
- Para os cálculos, as células são divididas em três grupos: 1. não chocou amostras de referência (definido como 100% de refolded firefly luciferase), 2. células sem chaperone molecular e calor chocado; 3. células com chaperone molecular e calor chocado.
6. Resultados representante
Refolding proteína está diretamente relacionada ao tempo de recuperação, portanto, para testar se o sistema está funcionando pro Perly, um ensaio deve ser realizada coleta de células em diferentes momentos. A correlação direta tempo / percentual de refolding indica que o experimento foi devidamente realizado e, portanto, representa um fator limitante. No entanto, deve ser sempre considerado que refolding após choque térmico é um evento saturando e, portanto, uma análise adequada do tempo é claro deve ser realizada antes de iniciar qualquer experimento.
Figura 1. Visão geral do experimento. Ensaio in vivo de refolding exige 3 a 4 dias para ser concluída. No dia 1 células são semeadas e transfectadas. As células são parceladas dia seguinte em um formato menor e no dia 3 de calor são chocados. Neste ponto é possível realizar o ensaio de luciferase logo após a colheita as células ou para salvar o pellet celular a -80 ° C e realizar o teste em outro momento
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Figura 2. Divisão celular. No dia 2 células dividem-se em uma placa de seis poços. Cada transfecção será diluído em um poço, a fim de ter todos os transfecção no mesmo prato. Cada placa irá corresponder a um tempo de recuperação especial além de uma placa de referência não chocado.
Figura 3. Bom resultado Representante. A. Porcentagem de refolding medido diretamente pela atividade firefly luciferase. Cada gráfico de barras representa a porcentagem de refolding na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de uma chaperone molecular em diferentes momentos de recuperação. B. Correlação entre tempo e redobrando na ausência (linha preta) e na presença (linha vermelha) de acompanhante. Os valores de r ao quadrado indicam boa correlação.
Em Fig.3A é mostrado um resultado representativo onde as células foram coletadas 15, 30, 45, 60 e 120 após choque térmico na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de chaperone molecular. Percentual de refolded aumenta luciferase com o tempo de recuperação prolongado e com a transfecção do chaperone molecular. A correlação entre refolding e tempo para o controle (Fig. 3B, linha preta) e do chaperone molecular células transfectadas (Fig. 3B, linha vermelha) é mostrado.
Figura 4. Representante mau resultado. A. Porcentagem de refolding medido diretamente pela atividade luciferase. Cada gráfico de barras representa a porcentagem de refolding na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de uma chaperone molecular em diferentes momentos de recuperação. B. Correlação entre tempo e redobrando na ausência e na presença (vermelho line) de acompanhante. Os valores de r ao quadrado indicam correlação ruim.
Figura 4A. Mostra um resultado representativo de uma experiência não adequadamente realizada. Tanto o controle (barras pretas) eo chaperone molecular transfectadas células (barras vermelhas) não mostraram um aumento na proteína refolding com o tempo. Além disso, transfecção do chaperone molecular não resultou em um aumento de renaturação. Esta baixa correlação é confirmada na fig. 4B mostrando um valor de r quadrados de 0,6619 e 0,1882, respectivamente, para o controle (linha preta) e do chaperone molecular transfectadas células (linha vermelha).