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Artigo de método

Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

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DOI:

10.3791/3545

⸱

6 de fevereiro de 2012

 ,  , 
1Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Protocolos para transplante de células germinativas e xeno tecidos testiculares são descritos. Germinativas resultados de células de transplante em doador-derivado espermatogênese em testículos beneficiárias, bem como representa um ensaio de reconstituição funcional para identificação de células-tronco espermatogónias (SSCS). Testículo tecido xeno reproduz o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies doadoras diferentes em camundongos receptores.

Resumo

Gérmen de transplante de células foi desenvolvido pelo Dr. Ralph Brinster e colegas da Universidade da Pensilvânia, em 1994, 1,2. Estes estudos inovadores mostraram que a microinjeção de células germinativas de camundongos doadores férteis no interior dos túbulos seminíferos de ratos inférteis receptor resulta em doador-derivado espermatogênese e produção de espermatozóides pelo animal destinatário 2. O uso de machos dadores que transportem a identificação gene bacteriano β-galactosidase permitido de doador-derivado espermatogênese e transmissão de o haplótipo o dador até ao a prole, pelos animais, destinatário 1. Surpreendentemente, após o transplante para dentro do lúmen dos túbulos seminíferos, as células germinativas transplantados eram capaz de se mover a partir do compartimento luminal para a membrana cave, onde espermatogônias estão localizados 3. É geralmente aceite que SSCs só são capazes de colonizar o nicho e restabelecer a espermatogênese nos testículos beneficiários. Portanto células germinativas,transplante oferece uma abordagem funcional para estudar o nicho de células-tronco nos testículos e caracterizar supostas células-tronco espermatogônias. Até à data, o transplante de células de gérmen é usado para elucidar a biologia célula básica do caule, para produzir animais transgénicos através da manipulação genética de células germinais antes do transplante 4,5, para estudar de Sertoli interação célula a célula de gérmen de 6,7, SSC homing e colonização 3, 8, bem como SSC auto-renovação e diferenciação 9,10.

Transplante de células germinativas é também viável em grandes espécies 11. Nestes, as principais aplicações são a preservação da fertilidade, a divulgação da genética nas populações animais de elite, e geração de animais transgênicos como o estudo da espermatogênese ea biologia SSC com esta técnica é logisticamente mais difícil e caro do que em roedores. Transplante de células germinais de espécies de grande porte no interior dos túbulos seminíferos de ratos resulta em colonizatíon de células doadoras e de expansão das espermatogónias, mas não na sua plena diferenciação presumivelmente devido à incompatibilidade do compartimento da célula destinatário somática com as células germinativas a partir de espécies filogeneticamente distantes 12. Uma abordagem alternativa é o transplante de células germinativas a partir de espécies de grandes juntamente com o seu compartimento de somática circundante. Nós relatada pela primeira vez em 2002, de que pequenos fragmentos de tecido testículo a partir de machos imaturos transplantados sob a pele dorsal de camundongos imunodeficientes são capazes de sobreviver e submetidos a um desenvolvimento pleno com a produção de esperma fertilização competente 13. Desde que, em seguida, tecido testículo xeno-enxerto tem sido mostrado para ser bem sucedido em muitas espécies e emergiu como uma alternativa valiosa para estudar o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de animais de grande porte em camundongos 14.

Protocolo

PARTE A. transplante de células germinativas em camundongos

1. Preparação de camundongos de destinatário

  1. Destinatários deve ser imunologicamente tolerante (quer seja geneticamente combinados a doadores ou imuno-deficientes) para as células testiculares dos doadores.
  2. Destinatários deve ser ou naturalmente desprovido de espermatogênese (por exemplo, W / W v camundongos) ou empobrecido de células germinais endógenas. Depleção de células Germ pode ser alcançado por irradiação ou drogas quimioterápicas, tais como O busulfan. Neste protocolo, descrevemos o método de preparação de ratos receptores com busulfan.
  3. Trate os destinatários em 4-6 semanas de idade através da injeção ip de busulfan. A dose óptima de O busulfan é a estirpe dependente. Em cepas de destinatário comumente usados, uma dose de 40-50 mg / kg é suficiente para empobrecem células germinativas endógena (por exemplo, 44 ​​mg / kg para ratinhos nus, 50 mg / kg para B6/129 destinatários F1).
  4. Dissolver O busulfan em pó em DMSO e em seguida, adicionar um volume igual de t de água destilada estérilÓ, façam uma concentração final de 4 mg / ml. Mantenha solução quente a 35-40 ° C antes de usar para evitar a precipitação dos O busulfan. Eliminar a solução que se precipitação é observado.
  5. Após o tratamento O busulfan, permitir que, pelo menos, um mês antes de usar destinatários. Os destinatários podem ser utilizadas entre 1 mês e 3 meses pós-tratamento com busulfan.

2. Preparação de pipetas de microinjecção

  1. Escolha pipetas de vidro de borosilicato (tubos capilares) com um diâmetro 1,0 milímetros exterior, uma 0,75 mm de diâmetro interior, e um comprimento de 3 polegadas.
  2. Siliconize pipetas de vidro com Sigmacote, enxaguar pipetas com metanol e secar com ar.
  3. Puxe as pipetas usando um extrator da pipeta. Máquinas diferentes extratores da pipeta ter configurações diferentes, portanto, testar algumas configurações. Geralmente, uma configuração semelhante ao utilizado para a tomada de pipetas de enucleação pode trabalhar.
  4. Quebre os pontas de pipeta sob microscópio de dissecação antes de usar para alcançar um diâmetro de aproximadamente 50 iMna ponta.

3. Preparação de células do doador para o transplante

  1. Choise da estirpe doador é dependente sobre a questão experimental estudada. Se quantificação da espermatogênese é usado como ponto de extremidade, o uso de doadores com um marcador facilmente identificável genética, tais como Lac-Z (por exemplo, B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J a partir de Jackson Laboratory) ou GFP (por exemplo, C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J a partir de Jackson Laboratory).
  2. Prepare a 7 ml de colagenase em DMEM menos 1 mg / ml, 4 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina acrescido de 1 mM de EDTA), e 2 ml de DNase em DMEM às 7 mg / ml. Este montante é para digerir 2 testículos camundongo doador.
  3. Coletar assepticamente testículos e remover a túnica albugínea. Spread túbulos seminíferos delicadamente com uma pinça fina para facilitar a digestão enzimática.
  4. Túbulos de transferência em colagenase, incubar a 37 ° C durante 5-10 min, e agitar freqüentemente.
  5. Lave túbulos duas vezes por fiação (200-300 g para 3 min) e re-que suspende em PBS w / o Ca 2 + +
  6. Re-suspender túbulos em tripsina-EDTA e agitar até que se torne pegajoso e nublado. Monitore a digestão de túbulos a 37 ° C como que ela deverá ocorrer no prazo de 1-2 min.
  7. Adicionar DNase e agite bem. Incubar durante 1-2 min.
  8. Adicionar 3 ml de FBS para parar a ação de enzimas.
  9. Suspensão de células filtro usando uma malha de nylon com 40-70 mM tamanho dos poros para remover células / tecido pedaços.
  10. Coletar as células a 600 g para 5 min e re-suspender as células em uma pequena quantidade de DMEM (
    • Contar as células e ajustar o volume para uma concentração final desejada (geralmente 100 x 10 6). Mantenha suspensão de células em gelo antes de usar.
    • Cada testículo O busulfan-tratados de mouse será preenchido com apenas 10-15 uL de suspensão de células. Devido ao potencial de desperdício e perdas, ter por objectivo a 30-50 ul por testículo.

4. Transplante de procedimento (Figura 1)

  1. Anestesiar os destinatários seguintes protocolos aprovados.
  2. Coloque em decúbito dorsaldecúbito e cirurgicamente preparar a área abdominal. Faça um ~ 1 centímetro incisão na linha média abdominal para expor a parede abdominal. Levante parede abdominal pelo uso de fórceps pequenas no ponto de a linha branca para evitar que acidentalmente ferindo órgãos abdominais, e proceder para fazer uma ~ incisão centímetros 0,5 menos da linha mediana da parede abdominal para expor a cavidade peritoneal.
  3. Use uma pinça íris para segurar a parede abdominal, e usar outro par de fórceps íris para procurar as bolsas de gordura ligados ao epidídimo e do testículo na cavidade peritoneal. Puxe delicadamente a almofada de gordura até que o testículo é exteriorizado e da artéria testicular e epidídimo são claramente visíveis. Os trabalhos sobre um testículo em um tempo.
  4. Coloque uma cortina fina estéril feita a partir de cartões de índice autoclavados debaixo da almofada de gordura / testículos para melhor identificação visual (opcional). A cortina também trabalha para absorver o líquido.
  5. Adicionar uma gota de Trypan corante Azul em a suspensão de células e, cuidadosamente, carregar o suspensão de células para o polyethytubagem de lene conectado a uma seringa de 1 ml. Anexar a pipeta puxado para dentro da tubulação e gentilmente forçar a suspensão de células para a pipeta através da aplicação de pressão para a seringa.
  6. Identificar os ductos eferentes (que liga o testículo ao epidídimo) e remova cuidadosamente tecido adiposo ao redor dos ductos. Trabalhe com cuidado, as condutas e da membrana ao redor deles são translúcidas.
  7. Insira com cuidado a pipeta em um duto no feixe dos dutos eferentes, gentilmente enrosque poucos milímetros em direção ao testículo.
  8. Evitando ao mesmo tempo movendo o pipeta de injeção, o alcance para a seringa, suavemente deprimir o êmbolo da seringa para garantir que a suspensão flui para o rete testis e nos túbulos seminíferos começam a encher.
  9. A taxa de injecção e de fluxo de suspensão de células é regulada por pressão do dedo polegar. Evitar o aumento súbito da pressão; monitorar o movimento de suspensão de túbulos.
  10. Pare a injeção quando quase todos os túbulos de superfície foram preenchidos antes do testículo começa a become isquêmica.
  11. Retorne o testículo para a cavidade abdominal. Repita o procedimento com o testículo contralateral. Suture a parede abdominal com 6-0 de sutura de seda e feche a pele com clips de feridas de metal. Monitorar camundongos em uma almofada de aquecimento até a recuperação completa.

5. Análise dos testículos de destinatário

  1. Permitir que de 2-4 meses após o transplante antes da análise.
  2. Euthanize o mouse destinatário de acordo com o cuidado com os animais e as diretrizes de uso e recolher o testículo e epidídimo em PBS. Quando um Lac-Z estirpe doador transgênico tem sido utilizado, o epidídimo pode ser usado como um controle de coloração positiva como ele tem atividade beta-galactosidase endógena.
  3. Para a detecção de células do doador por Lac-Z de coloração, resolver o problema o testículo para 1-2 horas a 4 ° C em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Enxágüe 3 x 30 min à temperatura ambiente em lacZ enxaguar buffer.
  4. Incubar durante a noite a 37 ° C em lacZ solução de coloração. Testículo pode ser manchado como um todo ou depois de dispersantedos túbulos.
  5. Corrigir e armazenar em 10% formalina tamponada neutra. Se seções são necessários usar o vermelho neutro rápido como contra-mancha.

PARTE B. ectópica xeno em camundongos

(De Dobrinski e Rathi 2008 15, e Rodriguez-Sosa et al. 2011 16).

1. Coleta de tecido de um doador

  1. Obter o tecido testículo por castração ou biópsia a partir de um do sexo masculino doador.
  2. Testículo Coloque em PBS ou biópsias em meio de cultura, mantendo condições estéreis.
  3. Mantenha o tecido coletadas em gelo e transporte para o laboratório.

2. Preparação de tecido do doador

  1. Realiza-se em o capô de cultura de tecido para manter a esterilidade.
  2. Lave cada testículo em antibióticos gelo-frios PBS contendo duas a três vezes antes de transferir o em uma cultura-prato com PBS. No caso de biópsias, lave fragmentos de testículo duas a três vezes com gelo-frio Medi culturauhm contendo antibióticos por girando em 150g para 2 min e ressuspensão em meio de cultura fresco gelo-frio.
  3. Para testículos intactos, remova túnica vaginal por fazer uma incisão ao longo da superfície e extrudar os testículo. Retire do testículo todas as estruturas Anexo (cordão espermático, epidídimo, o tecido conjuntivo). Lave testículos uma vez em PBS frio e transferência em uma cultura-prato com PBS.
  4. Cuidadosamente remova a túnica albugínea do testículo usando uma lâmina de bisturi e um par de tesouras. Se o testículo é muito pequena, da túnica pode ser removido por espremendo o tecido testicular para fora da túnica através de uma pequena incisão feita em uma extremidade enquanto segura a túnica com um par de fórceps pequenas sobre a outra extremidade.
  5. Dependendo do tamanho do testículo, quer o tecido testículo todo pode ser cortado em pequenos pedaços de em torno de 1 - 2 mm 3 em tamanho usando fórceps curvadas e uma lâmina de bisturi, ou de peças a grandes do tecido do testículo pode primeiro ser removidos a partir do testículo e, em seguida, cortadas em pequenospeças. Tudo isto deveria ser feito em gelo-frio meio de cultura e sob condições estéreis em um prato de cultura pequena (60 x15 mm).
  6. Transfira os fragmentos de tecido preparadas para o gelo-frio meio de cultura em pequenas culture-pratos em gelo até enxertia.

3. Castração de destinatário do mouse

  1. Anestesie do mouse como acima e preparar campo cirúrgico estéril por de grampeamento o cabelo (não é necessário em ratinhos nus), limpando-o com Etanol 70% e solução de Betadine.
  2. Faça um 0,5 -1 centímetros incisão da pele ventral linha mediana para expor a parede abdominal.
  3. Cuidadosamente expor o testículo, a artéria testicular e epidídimo tal como descrito no ParteA, 4,2-4,3.
  4. Retire a cauda da epididime do gubernáculo por dissecção romba.
  5. Ligadura a artéria testicular, e os ducto deferente de rato juntamente com o vaso sanguíneo com seda, e secção as estruturas com ligadura através do corte entre o testículo e a ligadura.
  6. Repita o procedimento para o secotestículo ª.
  7. Suture a parede abdominal com um ou dois pontos cirúrgicos.
  8. Feche a incisão da pele com um ou dois clips de Michel.

4. Ectópica xeno

  1. Posicione o mouse em decúbito ventral e preparar um campo cirúrgico estéril em sua parte traseira como acima.
  2. Dependendo de quantos enxertos são para ser inserido (geralmente 4-8/mouse), fazer do ~ 0,5 cm incisões na pele longos em cada lado da linha de meados de parte de trás do mouse.
  3. Use uma pinça para segurar uma borda da incisão na pele, e faça uma cavidade subcutânea por provocando além do tecido conjuntivo com uma tesoura.
  4. Usando um íris o local de fórceps um pedaço de testículo profunda do tecido para dentro da cavidade subcutânea, segurando a borda da incisão da pele com um outro fórceps íris.
  5. Feche a incisão na pele com um clipe de Michel e manter o mouse sobre almofada de aquecimento até que ele começa a se recuperar da anestesia.
  6. Transfira o mouse para uma gaiola com isolamento adicional e cover e monitor até que os ratos são totalmente recuperado.

5. Recolha de xenoenxertos testículos para análise e colheita de esperma

  1. Euthanize o mouse host de acordo com cuidados com os animais e as diretrizes de uso, e fazer uma incisão na pele na linha média sobre a pele running back da cauda para o pescoço e pele aberta. Isto expõe os enxertos quais podem ser localizadas, quer por o tecido subcutâneo ou anexado para a pele.
  2. Retire cuidadosamente os enxertos com uma pinça par e um par de tesouras.
  3. Número recorde de tamanho enxertos recuperados, e peso de enxertos individuais.
  4. Recuperar as vesículas seminais do abdome do rato e registar o seu peso como um indicador da produção de testosterona pelo tecido enxertado.
  5. Para análise histológica
    1. Suspender xenoenxertos em frasco para injectáveis ​​amostra contendo solução de Bouin (ou fixador de outro) em um volume ~~~V 10x que a do xenoenxerto, e frasco para injectáveis ​​rótulo de forma apropriada.
    2. Incubarnoite para o dia na geladeira seguida por lavagem pelo menos 3 vezes em etanol 70% em intervalos de 24 horas de preferência.
    3. Prossiga para o processamento e inclusão em parafina.
  6. Para a colheita de esperma
    1. Lave xenoenxertos por fiação-los para baixo, para 300g para 1 min e de ressuspender-los em meio de cultura contendo antibióticos.
    2. Cortar enxertos em pedaços pequenos e mince cuidadosamente com o fórceps em um prato de cultura de tecido contendo 3 - 5 ml de meio de cultura.
    3. Tecido picada filtro através do filtro da célula 40 mM.

PARTE resultados representativos C.

1. Gérmen de transplante de células

Se a suspensão de células transplantado doador contém células-tronco espermatogónias que transportem um marcador genético, tais como o transgene LacZ, a colonização do SSCs doadoras em que o testículo de destinatário pode ser visualizada por X-gal coloração como distintivos segmentos azuis do MEViniferous túbulos após 2-3 meses pós-transplante de 3 (Figura 2A). Uma colônia bem-estabelecida deve ter um trecho escuro de longo azul de segmentos de completamente cheios com duas ou mais camadas de células azuis mais estreitas para o centro, e as regiões coradas relativamente mais fracas em ambas as extremidades onde uma rede de único, emparelhado ou pequenos grupos de células azuis é aparente 3 (Figura 2B). A seção transversal do escuro região túbulo seminífero azul deveria revelar bem estabelecida e bem organizada espermatogênese com células germinativas azuis em vários estágios de diferenciação (Figura 2C).

2. Testículo tecido xeno

A viabilidade do tecido testicular após o transplante é inversamente correlacionado com o estágio de desenvolvimento do doador, o melhor resultado é obtido quando o tecido de machos recém-nascidos é usado, enquanto o tecido adulto mostra uma tendência de alta para se degeneram e morrem 17-21. Geralmente, o sucesso xenoenxerto diminui à medida que tecido do doador sofre-meiosis da primeira onda da espermatogênese. Tempo para a pleno desenvolvimento de tecido do doador imaturo e espermatogênese completo é específico da espécie, e muitas vezes um pouco mais curto em comparação com testículos em situ. O número de túbulos seminíferos com espermatogênese completo é variável conforme a espécie. Enquanto em ovinos, caprinos e suínos esse número é maior do que 50%, em bovinos e gatos ela é menos do que 15% 14 (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. Germ procedimento de transplante de células. Coloque destinatários em decúbito dorsal após a anestesia e fazer uma ~ 0.4 polegadas incisão mediana abdominal (A). Exponha testículo mediante a retirada do almofada de gordura anexado a do epidídimo e do testículo e coloque um drape fina estéril debaixo da almofada de gordura / testículo, para melhor identificação visual (B). Posicione o testículo e epidídimo de modo que os dutos eferentes, enterrados em a almofada de gordura são discerníveis (C, D, E). Identidade dos dutos eferentes e remova cuidadosamente tecido adiposo ao redor dos ductos. Um pedaço de papel colorido ou de plástico podem ser colocadas por debaixo das dutos para melhor visualização (G). Ruptura de ou moer a ponta da pipeta de acordo com o tamanho dos ductos e suspensão célula de carga para a pipeta (H). Insira com cuidado a pipeta em um duto no feixe dos dutos eferentes, gentilmente enrosque poucos milímetros em direção ao testículo (a seta em H mostra a direção da pipeta de injeção e threading). Um testículo com injeção de sucesso em túbulos seminíferos é mostrada (I). Ts: Testículo; Ep: epidídimo.

Figura 2
Figura 2. Os resultados representativos para o transplante de células germinativas A) Um testículo injetados coradas com X-gal. Os segmentos azuis dos túbulos seminíferos representam colônias estabelecidas a partir de doadores transgênicos SSC (lacZ transgene). B) Maior ampliação de uma colônia SSC em 3 meses pós-transplante. Thde e região azul-escuro no centro representa a espermatogênese completa e as regiões pálidos azuis nas extremidades representam extensão crescente de a colônia. C) Um corte histológico do escuro túbulo seminífero azul (3 meses pós-transplante) mostra espermatogênese bem organizado. Barras de escala em B e C são 200 mM e 30 æM, respectivamente. (Figuras adaptado a partir Annu Célula Rev Dev Biol 2008;. 24:263-86 e Biol Reprod 1999 junho;. 60 (6) :1429-36).

Figura 3
Figura 3. Xeno ectópica de tecido dos testículos imaturos de animais de grande porte em ratos imunodeficientes. Fragmentos de testículo doadores imaturos (~ 1 mm 3) transplantados sob a pele dorsal de ratos imunodeficientes (A) são capazes de sobreviver e responder às gonadotrofinas do rato. Como resultado, o tecido testículo sofre de desenvolvimento completo, incluindo a formação de esperma fertilização competente (B). Uma vez xenoenxerto de testículo são coletados (C)eles podem ser usados ​​para a análise ou para obter esperma (D) para ICSI (E) e de produção de embriões (F). Bares igualdade de 50 um (B, E e F) or 10 iM (D). (Modificado de Rodriguez-Sosa e Dobrinksi 2009 14).

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Discussão

1. Gérmen de transplante de células

Gérmen de transplante de células fornece o ensaio somente funcional para a confirmação inequívoca de a presença de células-tronco espermatogónias (SSCs) em uma população de células. SSC só pode casa e colonizar o nicho SSC na membrana basal e iniciar doador-derivado espermatogênese. Gérmen de transplante de células tornou possível para estudar e manipular SSCs em uma forma sem precedentes. A técnica tem sido utilizada para produzir animais transgénicos atrav...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Trabalho de laboratório autores tem sido apoiada pela USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) e Alberta Inova - Health Solutions.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
Colagenase (tipo IV) Sigma C5138
Tripsina-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypan azul Invitrogen 15250-061
Filtro de nylon de malha celular BD Biosciences 352340 (40μm)
352350 (70μm)
Busulfan Sigma B2635
De parede fina capilares de vidro Instrumento de precisão Mundial TW 100-3
BD tubulação plyethylene intramedic (PE100) BD CA-63018-725
Ethicon fio de seda 6-0 Ethicon 706G
Grampos de sutura BD 427631
Sigmacote Sigma SL2
X-gal Sigma B4252
Ferrocianeto de potássio Sigma P9387
Ferricianeto de potássio Sigma P3667
cloreto de magnésio Sigma 208337
desoxicolato de sódio Sigma D6750
N, N-Dimetilformamida Sigma D4551
Igepal CA-630 Sigma 18896

Referências

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