Artigo de método

Diagnóstico da tuberculose pulmonar com o teste Xpert MTB / RIF

84.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/3547

⸱

9 de abril de 2012

 , 
1Institute for Infectious Diseases, University of Bern, 2MCL Laboratories Inc.

Neste artigo

Resumo

O teste Xpert MTB/RIF integra descontaminação da amostra, operação sem contato manual, processamento da amostra em tempo real e PCR hemi-aninhada ultra-sensível para a detecção simultânea de Mycobacterium tuberculosis e resistência à rifampicina, seja em escarro expelido ou em sedimentos de escarro concentrados, em aproximadamente duas horas. O teste é padronizado e requer apenas infraestrutura laboratorial moderada e treinamento.

Resumo

A tuberculose (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) continua sendo um importante problema de saúde pública: a infecção afeta até um terço da população mundial1, e quase dois milhões de pessoas morrem de TB a cada ano.2 O acesso universal a um tratamento de alta qualidade centrado no paciente para todos os pacientes com TB é enfatizado pela Estratégia da OMS para Erradicação da TB.3 A detecção rápida de MTB em espécimes respiratórios e a terapia medicamentosa baseada em resultados confiáveis de testes de resistência a medicamentos são pré-requisitos para a implementação bem-sucedida dessa estratégia. No entanto, em muitas regiões do mundo, o diagnóstico da TB ainda depende de métodos de microscopia de escarro insensíveis e pouco padronizados. A detecção ineficaz da TB e o surgimento e a transmissão de cepas de MTB resistentes a medicamentos colocam cada vez mais em risco as atividades globais de controle da TB.2

O diagnóstico eficaz da tuberculose pulmonar exige a disponibilidade em escala global de ferramentas diagnósticas padronizadas, fáceis de usar e robustas, que permitam a detecção direta do complexo MTB e da resistência a antibióticos-chave, como a rifampicina (RIF). Esse último resultado pode servir como marcador para o MTB multirresistente (TB-MR) e tem sido relatado em > 95% dos isolados de TB-MR.4, 5 A disponibilidade rápida de resultados confiáveis de testes provavelmente se traduzirá diretamente em decisões sólidas de manejo do paciente que, em última instância, curarão o paciente individual e interromperão a cadeia de transmissão da tuberculose na comunidade.2

O ensaio Xpert MTB/RIF da Cepheid (Sunnyvale, CA, EUA)6, 7 atende de forma notável às exigências descritas acima. Trata-se de um teste de amplificação de ácidos nucleicos para: 1) a detecção do DNA do complexo MTB em escarro ou sedimentos de escarro concentrado; e 2) a detecção de mutações associadas à resistência à RIF no gene rpoB8. Foi projetado para uso com o sistema GeneXpert Dx da Cepheid, que integra e automatiza o processamento de amostras, amplificação de ácidos nucleicos e detecção de sequências-alvo por meio de PCR em tempo real e PCR com transcriptase reversa. O sistema é composto por um instrumento, um computador pessoal, um leitor de código de barras e um software pré-carregado para execução dos testes e visualização dos resultados9. Utiliza cartuchos descartáveis de uso único Xpert MTB/RIF, que contêm os reagentes de PCR e onde ocorre o processo de PCR. Como os cartuchos são autossuficientes, a contaminação cruzada entre amostras é eliminada6. Os métodos atuais de amplificação de ácidos nucleicos utilizados para detectar MTB são complexos, trabalhosos e tecnicamente exigentes. O ensaio Xpert MTB/RIF tem o potencial de levar testes diagnósticos padronizados, sensíveis e altamente específicos para tuberculose e resistência a medicamentos a ambientes universais de atendimento à beira do leito3, desde que esses locais possam arcar com seu custo. Para facilitar o acesso, a Fundação para Diagnósticos Inovadores (FIND) negociou reduções significativas de preço. Os preços atuais negociados pela FIND, juntamente com a lista de países elegíveis para os descontos, estão disponíveis na web10.

Protocolo

O padrão 2 das Normas Internacionais para o Tratamento da Tuberculose afirma que todos os pacientes suspeitos de ter tuberculose pulmonar devem fornecer pelo menos duas amostras de escarro para exame bacteriológico. Sempre que possível, pelo menos uma amostra matinal deve ser coletada, pois o escarro coletado nesse horário apresenta maior rendimento.11 O ensaio Xpert MTB/RIF pode ser aplicado a amostras de escarro ou sedimentos de escarro concentrados, preparados a partir de escarros induzidos ou espontâneos, sejam eles positivos ou negativos para bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) no exame direto.6, 12, 13 O ensaio destina-se ao uso com espécimes de pacientes com suspeita clínica de tuberculose pulmonar que: 1) não receberam terapia antituberculosa, 2) tiveram < 7 dias de terapia, ou 3) não receberam terapia nos últimos 60 dias. Observe que ele não deve ser utilizado para monitorar os efeitos da terapia medicamentosa7, pois o DNA bacteriano pode persistir após o tratamento antimicrobiano.

Trate espécimes clínicos, incluindo cartuchos usados, como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. Utilize precauções adequadas, como o uso de luvas descartáveis de proteção, jalecos laboratoriais e proteção ocular, e siga os procedimentos e diretrizes de segurança da sua instituição.

1. Amostras de Escarro Expectorado

Observação: Processe apenas tantos espécimes de cada vez quantos forem os módulos disponíveis no sistema GeneXpert Dx para executar o teste!

  1. Rotule cada cartucho Xpert MTB/RIF com o ID do espécime correspondente.
  2. Transfira 1,0 ml de escarro expectorado para um tubo cônico com tampa de rosca utilizando uma pipeta de transferência estéril. Alternativamente, todo o espécime pode ser processado no recipiente original de coleta de escarro à prova de vazamentos.
  3. Adicione 2,0 ml do Reagente para Amostra Xpert MTB/RIF (2:1; v/v) ao escarro expectorado utilizando uma pipeta de transferência estéril.
  4. Recoloque a tampa e agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, a mistura pode ser agitada em vórtex (30 segundos).
  5. Deixe o tubo em posição vertical por 5 minutos à temperatura ambiente.
  6. Agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, utilize um vórtex (30 segundos).
  7. Deixe o tubo em posição vertical por mais 10 minutos à temperatura ambiente.
  8. Examine os espécimes: as amostras devem estar liquefeitas, sem grumos visíveis de escarro.

2. Sedimentos Concentrados

Observação: Processe apenas tantos espécimes de cada vez quantos forem os módulos disponíveis no sistema GeneXpert Dx para executar os testes!

  1. Rotule cada cartucho Xpert MTB/RIF com o ID correspondente da amostra.
  2. Transfira 1,5 ml do Reagente para Amostra Xpert MTB/RIF para um tubo cônico com tampa de rosca, utilizando uma pipeta de transferência estéril.
  3. Adicione pelo menos 0,5 ml do sedimento concentrado ao tubo contendo o Reagente para Amostra, utilizando uma pipeta de transferência estéril.
  4. Recoloque a tampa e agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, utilize um vórtex (30 segundos).
  5. Deixe o tubo em posição vertical por 5 minutos à temperatura ambiente.
  6. Agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, utilize um vórtex (30 segundos).
  7. Deixe o tubo em posição vertical por mais 10 minutos à temperatura ambiente.
  8. Inspeccione as amostras: os espécimes devem estar liquefeitos, sem grumos visíveis de escarro.

3. Carregamento do Cartucho Xpert MTB/RIF

Observação: Inicie o teste dentro de 30 minutos após adicionar a amostra à cartela!

  1. Verifique as etiquetas no cartucho Xpert MTB/RIF e no ID da amostra.
  2. Abra a tampa do cartucho.
  3. Usando a pipeta de transferência estéril fornecida, aspire a amostra liquefeita para dentro da pipeta até que o menisco esteja acima da marca mínima e transfira a amostra para a abertura aberta do cartucho Xpert MTB/RIF.

Observação: Dispense lentamente para minimizar o risco de formação de aerossóis!

  1. Feche a tampa do cartucho.

4. Iniciando o Teste

Observação: Antes de iniciar o teste, certifique-se de que o sistema GeneXpert Dx esteja equipado com o software GX2.1 e de que o ensaio Xpert MTB/RIF tenha sido importado para o software! 9

  1. Ligue o computador e, em seguida, ligue o instrumento GeneXpert Dx.
  2. No desktop do Windows, clique duas vezes no ícone de atalho do GeneXpert Dx.
  3. Faça login no software do Sistema GeneXpert Dx utilizando seu nome de usuário e senha.
  4. Na janela do Sistema GeneXpert Dx, clique em Criar Teste. A caixa de diálogo Ler Código de Barras do Cartucho aparece.
  5. No campo ID da Amostra, leia ou digite o ID da amostra.
  6. Leia o código de barras do cartucho Xpert MTB/RIF. A janela Criar Teste aparece.
  7. Clique em Iniciar Teste e insira sua senha na caixa de diálogo que aparece.
  8. Abra a porta do módulo do instrumento com a luz verde piscando e insira o cartucho.
  9. Feche a porta. O teste é iniciado e a luz deixa de piscar, permanecendo constantemente verde. Quando o teste for concluído, a luz se apaga.
  10. Aguarde até que o sistema libere o travamento da porta ao final do processo, abra a porta do módulo e remova o cartucho.
  11. Descarte os cartuchos usados nos recipientes apropriados para resíduos, de acordo com as práticas-padrão da sua instituição.

5. Resultados Representativos

Cada cartucho Xpert MTB/RIF inclui reagentes para a detecção do complexo MTB e da resistência à RIF, bem como um controle de processamento da amostra (SPC) para verificar o processamento adequado da bactéria-alvo e monitorar a presença de inibidor(es) na reação de PCR. O controle de verificação da sonda (PCC) confirma a reidratação dos reagentes, o preenchimento do tubo de PCR no cartucho, a integridade da sonda e a estabilidade do corante.9 Os iniciadores no ensaio Xpert MTB/RIF amplificam uma porção do gene rpoB que contém a região "central" de 81 pares de bases. Cinco sondas de hibridização de ácidos nucleicos fluorogênicas com cores diferentes, denominadas balizas moleculares, analisam toda a região central de 81 pb.14 Cada baliza molecular foi projetada para ser tão específica que não se liga ao seu alvo se a sequência-alvo diferir da sequência selvagem de rpoB por apenas uma substituição de nucleotídeo. Como as balizas moleculares emitem fluorescência apenas quando ligadas aos seus alvos, ou seja, à sequência selvagem de rpoB, a ausência de qualquer uma das cinco cores no ensaio diferencia a sequência conservada selvagem das mutações na região central associadas à resistência à RIF.6

O CPS deve ser positivo em uma amostra negativa e pode ser negativo ou positivo em uma amostra positiva. O resultado do teste será "Inválido" se o CPS não for detectado em um teste negativo. Antes do início da reação de PCR, o sistema GeneXpert Dx mede o sinal de fluorescência dos sondas para monitorar a reidratação das microesferas, o preenchimento do tubo de reação, a integridade das sondas e a estabilidade do corante. O CPS é aprovado se o sinal de fluorescência das sondas atender aos critérios de aceitação atribuídos. Os resultados são interpretados pelo sistema GeneXpert Dx a partir dos sinais de fluorescência medidos e de algoritmos de cálculo embutidos e são exibidos na janela Visualizar Resultados9, conforme indicado abaixo:

MTB Detectado: O DNA alvo do MTB é detectado; ambos os controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação estabelecidos. Valores de Ct mais baixos representam uma concentração inicial mais alta de molde de DNA; valores de Ct mais altos representam uma concentração mais baixa de molde de DNA. Nos resultados de MTB DETECTADO, "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA DETECTADA" (Figura 1A), "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA NÃO DETECTADA" (Figura 1B) ou "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA INDETERMINADA" serão exibidos em uma linha separada.

MTB Não Detectado: O DNA alvo de MTB não é detectado; ambas as controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação estabelecidos (Figura 2).

Inválido: A presença ou ausência de MTB não pode ser determinada: o controle de processo de amostra (SPC) não atende aos critérios de aceitação, ou seja, a amostra não foi adequadamente processada ou houve inibição da PCR (Figura 3). Observação: repetir o teste com espécime adicional!

Erro: Um ou mais dos resultados do PCC falharam (FAIL). Tanto o MTB quanto o SPC exibem NENHUM RESULTADO. Observação: repetir o teste com espécime adicional! Se o PCC for aprovado (PASS), o erro é causado por uma falha em um componente do sistema.

Figura 1: O DNA alvo de MTB é detectado; ambos os controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação atribuídos. Valores de Ct mais baixos representam uma concentração inicial mais alta do molde de DNA; valores de Ct mais altos representam uma concentração mais baixa do molde de DNA. Nos resultados de MTB DETECTADO, "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA NÃO DETECTADA" (Figura 1A), "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA DETECTADA" (Figura 1B) ou "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA INDETERMINADA" serão exibidos em uma linha separada.

Interface do sistema GeneXpert mostrando resultados diagnósticos de MTB e curvas primárias de fluorescência.
Figura 1A. MTB DETECTADO; Resistência à RIF NÃO DETECTADA, ou seja, apenas a sequência de ácido nucleico selvagem da região determinante de resistência à RIF (RRDR) de 81 pb do gene rpoB estava presente.6 Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Interface do software diagnóstico GeneXpert; gráfico de análise de PCR; resultados da detecção de MTB/RIF.
Figura 1B. MTB DETECTADO; RESISTÊNCIA À RIF DETECTADA. Queda completa da sonda B (seta), que cobre as posições 513 a 517 da RRDR do gene rpoB.6 No exemplo, o sequenciamento parcial revelou que foi detectada a mutação D516V no gene rpoB.8 Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Interface do sistema GeneXpert Dx, resultado do ensaio Xpert MTB-RIF, gráfico de PCR mostrando ciclo de detecção de MTB.
Figura 2. O DNA alvo de MTB não foi detectado; ambos os controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação estabelecidos. Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Interface do sistema GeneXpert Dx; diagrama de análise de PCR com dados de fluorescência nos resultados do teste.
Figura 3. Resultado de teste inválido, ou seja, a presença ou ausência de MTB não pode ser determinada: o controle de processo de amostra (SPC) não atende aos critérios de aceitação, porque a amostra não foi adequadamente processada ou porque a PCR foi inibida. Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Discussão

O ensaio Xpert MTB/RIF integra descontaminação da amostra, operação sem contato manual, processamento automático da amostra e PCR hemi-aninhada ultra-sensível para a detecção simultânea de MTB e resistência à RIF, seja em escarro expelido ou em sedimentos concentrados, em um único sistema de fácil utilização. O limite analítico de detecção do ensaio foi determinado em 131 UFC/ml de escarro.6 A relação log-linear entre os valores de Ct e o número de células de MTB presentes é válida de 102 a 107 UFC/ml de escarro. Como as concentrações clínica relevantes de MTB estão todas dentro da faixa linear do ensaio, este fornece estimativas semi-quantitativas da carga bacteriana.7 O ensaio exige apenas infraestrutura laboratorial moderada e treinamento básico. O limite de detecção é pelo menos duas ordens de magnitude inferior ao da microscopia convencional.6 A especificidade é excelente. Além disso, a detecção simultânea de MTB resistente à RIF representa uma vantagem significativa no contexto de testes realizados no local de atendimento, na era da tuberculose resistente a medicamentos.3

Até o momento, existem apenas dados publicados limitados sobre o desempenho do ensaio no diagnóstico da tuberculose pulmonar em ambientes clínicos.12; 13 A sensibilidade clínica geral do ensaio Xpert MTB/RIF na detecção de MTB em escarro de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar foi de 97,6% quando comparada à cultura como referência. Esses foram os resultados de um estudo prospectivo multicêntrico que envolveu cinco locais de pesquisa (Lima, Peru; Baku, Azerbaijão; Cidade do Cabo e Durban, África do Sul; Mumbai, Índia) e um total de 1462 pacientes. A probabilidade pré-teste geral de tuberculose confirmada por cultura na população estudada foi de 50,7%. A sensibilidade foi de 99,8% para casos positivos ao baciloscópico e à cultura e de 90,2% para casos negativos ao baciloscópico, mas positivos à cultura. Entre pacientes HIV-positivos com tuberculose pulmonar, a sensibilidade do teste MTB/RIF foi de 93,9%, comparada a 98,4% em pacientes HIV-negativos.12 Em um contexto de baixa prevalência de tuberculose, a concordância geral para detecção de MTB foi de 89% quando comparada à cultura; a sensibilidade foi de 98% para espécimes positivos ao baciloscópico e de 72% para espécimes negativos ao baciloscópico, respectivamente, e a especificidade foi excelente.13 Não houve diferença significativa na sensibilidade entre testes realizados em escarro não tratado e em sedimentos concentrados.12 No mesmo estudo, o teste MTB/RIF detectou corretamente a resistência à RIF em 209 dos 211 pacientes (sensibilidade de 99,1%) e em todos os 506 pacientes com suscetibilidade à RIF (especificidade de 100%), levando-se em conta os resultados do sequenciamento.12 Os autores constataram que o desempenho tanto na detecção de casos quanto na discriminação da resistência à RIF foi semelhante em diferentes locais, sugerindo que os achados provavelmente sejam amplamente aplicáveis.12 Além disso, sedimentos concentrados de espécimes respiratórios diferentes do escarro, como lavado broncoalveolar e secreções brônquicas, foram testados com sensibilidade e especificidade comparáveis.13 Dados sobre o desempenho do ensaio no diagnóstico da tuberculose extrapulmonar estão surgindo.15

O controle global da tuberculose precisa urgentemente de ferramentas eficazes que permitam o diagnóstico rápido de novos casos de TB e a detecção de MTB resistente à RIF em ambientes universais de atendimento na atenção básica.3 Os métodos atuais de amplificação de ácidos nucleicos utilizados para detectar MTB são complexos, trabalhosos e tecnicamente exigentes. O ensaio Xpert MTB/RIF tem o potencial de levar testes diagnósticos padronizados, sensíveis e altamente específicos para tuberculose e resistência a medicamentos a esses ambientes, desde que possam arcar com os custos. Para facilitar o acesso, a Fundação para Diagnósticos Inovadores (FIND) negociou reduções significativas de preço para o teste Xpert MTB/RIF. Os preços atuais negociados pela FIND, juntamente com a lista de países elegíveis para os descontos, estão disponíveis na web.10

Divulgações

Nenhum conflito de interesses declarado.

Agradecimentos

Os autores agradecem a W. J. Looney pela revisão cuidadosa do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Teste Xpert MTB/RIFCepheidGXMTB/RIF-10
Pipetas de transferênciaSarstedt Ltd86.1172.001
Tubos cônicos, 15 ml, 120 x 17 mm, PSSarstedt Ltd62.553.542

Referências

  1. Sudre, P., Dam, ten, Chan, G., C,, Kochi, A. Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation. World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).
  2. World Health Organisation. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. WHO report 2010. , (2010).
  3. The global plan to stop TB, 2006-2015. , World Health Organization. Geneva. (2006).
  4. Morris, S., et al. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis. 171, 954-960 (1995).
  5. Traore, H., Fissette, K., Bastian, I., Devleeschouwer, M., Portaels, F. Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as aninitial indicator of multidrug resistance. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4, 481-484 (2000).
  6. Helb, D., et al. Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237 (2010).
  7. Blakemore, R., et al. Evaluation of the Analytical Performance of the Xpert MTB/RIF. Assay. J. Clin. Microbiol. 48, 2495-2501 (2010).
  8. Telenti, A., et al. Detection of rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Lancet. 341, 647-650 (1993).
  9. GeneXpert Dx System Operator Manual. , Cepheid Inc. Sunnyvale, CA, USA. (2011).
  10. Foundation for new innovative diagnostics [Internet]. , Geneva, Switzerland. Available from: http://www.finddiagnostics.org/about/what_we_do/successes/find-negotiated-prices/xpert_mtb_rif.html (2011).
  11. International Standards for Tuberculosis Care (ISTC). , Tuberculosis Coalition for Technical Assistance. The Hague. (2009).
  12. Boehme, C. C., et al. Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
  13. Marlowe, E. M., et al. Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for the Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory Specimens. J. Clin. Microbiol. 49, 1621-1623 (2011).
  14. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. M., Tyagi, S., Kramer, F. R., Alland, D. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons. J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).
  15. Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system. J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Ensaio Xpert MTB RIFDiagn stico de TuberculoseDetec o de Resist ncia RifampicinaSistema GeneXpert DxProcessamento de Amostra de EscarroPCR em Tempo RealAmplifica o de cidos NucleicosMycobacterium tuberculosisTestes de Resist ncia a MedicamentosTestes Point of Care

Artigos relacionados