Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos

Resumo

Descrevemos como executar infecções retrovirais ou lentiviral de superexpressão ou shRNA contendo constrói no ser humano Ramos linhagem de células-B e como medida de mutação somática nestas células.

Resumo

Células B começam sua vida com os anticorpos de baixa afinidade gerada pela recombinação V (D) J. No entanto, após a detecção de um patógeno, a variável região (V) de um gene de imunoglobulina (Ig) é mutante aproximadamente 100.000 vezes mais do que o resto do genoma através hipermutação somática (SHM), resultando em alta ^{de 1,2} anticorpos de afinidade. Além disso, a recombinação classe switch (CSR) produz anticorpos com diferentes funções efetoras, dependendo do tipo de resposta imune que é necessário para um determinado patógeno. Ambos RSE e SHM são iniciadas pela ativação induzida citidina desaminase (AID), que deaminatos resíduos citosina no DNA para produzir uracils. Estes uracils são processados ​​por formas propenso a erros de vias de reparo, acabou levando a mutações e recombinação ^1-3.

Nossa compreensão atual dos detalhes moleculares da SHM ea RSE vêm de uma combinação de estudos em camundongos, células primárias, linhas de células, e células-fexperimentos ree. Modelos de ratos permanecem o padrão-ouro com nocautes genética mostrando papéis críticos para reparar muitos fatores (por exemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerase η) ^4-10. No entanto, nem todos os genes são passíveis de estudos nocaute. Por exemplo, nocautes de várias cadeias duplas proteínas de reparo estão embrionariamente quebrar letal ou prejudicar o desenvolvimento das células B ^11-14. Além disso, por vezes, a função específica de uma proteína em SHM ou CSR pode ser mascarada por mais defeitos global causado pelo nocaute. Além disso, desde experimentos em camundongos pode ser demorado, alterando a expressão de genes individuais em linhas de celular tornou-se um passo cada vez mais popular primeiro a identificar e caracterizar genes candidatos ^15-18.

Ramos - uma linha de células de linfoma de Burkitt que constitutivamente sofre SHM - tem sido um modelo de celular da linha popular de estudo SHM ^18-24. Uma vantagem das células Ramos é que eles têm uma semi built-in conveniente-Quantitativa medida da SHM. Células de tipo selvagem expressar IgM e, como eles peguem mutações, algumas das mutações knock out expressão IgM. Portanto, dosagem de perda de IgM por fluorescência-ativado de varredura de células (FACS) fornece uma rápida leitura para fora para o nível de SHM. A medida mais quantitativa da SHM pode ser obtida diretamente seqüenciamento dos genes dos anticorpos.

Como as células Ramos são difíceis de transfecção, que produzem derivados estáveis ​​que têm aumentado ou abaixado expressão de um gene individual por infectar as células com construções retroviral ou lentiviral que contêm um cassete de superexpressão ou um curto hairpin RNA (shRNA), respectivamente. Aqui, descrevemos como nos infectar as células Ramos e depois usar essas células para investigar o papel de genes específicos em SHM (Figura 1).

Protocolo

1. Amostras de preparação e células

1. Realizar uma preparação de médio porte de DNA (midiprep) da superexpressão ou shRNA contendo construções e as embalagens retroviral vector pKat2 ou os vetores embalagem lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE e PRSV-Rev ^25. Use 6 mg DNA para cada construção e ou mcg 4 de pKat2 (para infecções retrovirais) ou 1,5 mg de DNA para cada um dos pVSV-g, pMDLg / pRRE, e vetores PRSV-Rev embalagem (para infecções lentiviral).
2. Prepare BOSC 23 meios de comunicação. Para transfecção, use ambas as médias não emendada Dulbecco modificado Eagle (DMEM), bem como DMEM completo. Para fazer DMEM completo, adicionar 1% tampão HEPES, 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (PGS), e 10% soro bovino recém-nascidos (NCS) para uma garrafa de DMEM.
3. Prepare Ramos mídia. Para a etapa de infecção, tornam completo RPMI-1640 (RPMI) pela adição de HEPES 1%, PGS 1% e 10% de soro fetal bovino (FBS) para uma garrafa de RPMI. Para a etapa única célula semeadura, make "condicionados" media crescendo células Ramos em RPMI completo para dois dias, girando as células para baixo a 400 X g por 4 minutos e filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,2 m em um frasco estéril. À semelhança de outros meios de comunicação completa, media condicionado é armazenada a 4 ° C até serem necessárias.
4. Dividido 3 x 10 ⁶ BOSC 23 células em um prato de 100 mm em 10 mL DMEM completo no dia anterior transfecção de modo que as células serão a 50-60% da confluência dias de transfecção. Faça uma placa de células para cada vetor você planeja transfecting. É importante que as células não foram mantidas em cultura por muito tempo; usar células passagem baixo número ou células recém-descongeladas tanto para transfecção e infecção passos para garantir uma boa infecção.
5. Incluem controles para suas experiências. Para transfections e infecções, criar um controle negativo (células não infectadas ou untransfected) e um controle positivo (vírus que expressa GFP e puromicina resistência gene). Para shRNA exper knock-downiments, infectar um poço com uma embaralhada ou controle shRNA irrelevante.

2. Transfecting BOSC 23 células

1. Aquecer a garrafas de DMEM e DMEM sem alterações, completa a 37 ° C.
2. Remova a mídia da BOSC 23 células e substituir com 5 mL de DMEM completo. As células voltem ao a 37 ° C até o uso da incubadora no passo 2.6.
3. Aquecer a garrafa de FuGENE 6 em temperatura ambiente por 5 minutos e brevemente vortex (<1 segundo).
4. Alíquota de 600 mL DMEM sem alterações, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
5. Diluir 30 mL FuGENE 6 na 600 mL DMEM sem alterações, brevemente vortex (<1 segundo), e depois deixe em temperatura ambiente por cinco minutos. Tenha o cuidado de pipetar diretamente na mídia. Não deixe que os 6 FuGENE tocar os lados do tubo.
6. Adicionar 6 mg construir e ou 4 mg pKat2 (infecções retrovirais) ou 1,5 mg cada um dos pMDLg, pVSV-G / pRRE e PRSV-Rev (infecções lentiviral) para o DMEM / 6 FuGENE mix, vortex bri efly (<1 segundo), e depois deixe em temperatura ambiente por 25 minutos.
7. Adicione o DNA / DMEM / 6 FuGENE mix para o BOSC 23 células e retornar para a 37 ° C incubadora por 24 horas.
8. Após 24 horas, adicionar 5 mL DMEM completo para as células transfectadas e retornar para a 37 ° C incubadora por mais 24 horas.

3. Colheita partículas virais

1. Colheita os 10 ml de mídia da transfectadas BOSC 23 células com uma seringa de 10 mL.
2. Anexar um 0,45 mM filtro para o final da seringa e do filtro da mídia em um tubo limpo de polipropileno de 15 mL.
3. Use a mídia viral imediatamente ou congelar como um alíquotas mL em 2 mL frascos criogênicos a -80 ° C.
4. Após a colheita os meios de comunicação viral, confirmam que a transfecção eficiente ocorreu nas células controle positivo por FACS. Isso também pode ser feito para todas as amostras se a construir contém quer um (GFP, por exemplo) ou um marcador fluorescente na superfície celular (por exemplo, Thy1).

ESIGNAÇÃO "> 4. Infectar células B

1. ML de semente 2 de 2 x 10 ⁵ células / mL Ramos células em RPMI completo em uma placa 6-bem 24 horas antes da infecção. Novamente, não se esqueça de usar células passagem baixo número ou células recentemente descongelada para garantir a boa infecção.
2. Se usar alíquotas de vírus congelados, descongele a mídia viral rapidamente a 37 ° C.
3. Misture 1 mL de mídia viral com 3 mL de 10 polibrene mg / mL. A concentração final de polibrene deverá ser de 10 mcg / mL em um volume total de 3 mL.
4. Adicione a mistura de vírus / polibrene para as células e misture bem por pipetagem. Como mencionado anteriormente, um bem deve ser usado como um controle não infectados; adicionar 1 mL RPMI completo e 3 mL polibrene a este bem, em vez de vírus de 1 mL. Certifique-se de infectar um bem com um controle pareado negativo. Nós também infectar um bem com um vetor contendo GFP, para determinar a eficiência de infecção por FACS.
5. Centrifugar a placa de 6 poços em 3000 X g por 90 minutos em temperatura ambiente.
6. Devolver a placa paraa 37 ° C incubadora por 48 horas.
7. Após 48 horas, girar as células infectadas em um tubo de polipropileno de 15 mL a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. Remova a mídia por aspiração, certificando-se de não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em RPMI fresco.
8. Confirmar a eficiência de infecção na amostra de controlo positivo por FACS. Como antes, você pode fazer isso para todas as suas amostras, se a construção contém quer um (GFP, por exemplo) ou um marcador fluorescente na superfície celular (por exemplo, Thy1).
9. Iniciar seleção de células (se for o caso). Nosso shRNA contendo construções contêm um cassete de resistência puromicina. Nós selecionamos as células infectadas shRNA Ramos com 0,25 mcg / mL puromicina. Nós encontramos que os derivados de células Ramos, por vezes mostram alterações suscetibilidade a puromicina e, portanto, realizamos matar curvas para otimizar a concentração de puromicina para cada derivado. Também tratar células controle não infectadas com puromicina para confirmar que a seleção é eficaz.

5. Semeadura única célula

Semeadura só pode ser realizada de duas maneiras: por FACS classificação ou manualmente.

1. FACS: Use um classificador FACS com um adaptador de placa para celular sementes 1 / bem em uma placa de 96 poços pré-cheia com 100 mL de 40% RPMI/40% condicionado media/20% FBS. Este método dá um monte de clones celulares mais simples por placa.
2. Manualmente: Contagem das células. Diluir uma alíquota de células a 10 células / mL em 40% RPMI/40% condicionado media/20% FBS. Use 10 mL de células diluída para cada placa semeada. Diferentes clones irá mostrar recuperação variável nesta fase, portanto, é útil a criação de várias chapas em diferentes concentrações (variando de 3 a 20 células / mL). Use aquele que produz conseqüências menos para evitar clones resultantes de várias células). Use uma pipeta multicanal para sementes de placas de 96 poços com 100 mL de células diluída.
3. Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 2 semanas.
4. Verificação individual poços under ao microscópio para confirmar a presença de células um dia após a semeadura. Células individuais podem ser difíceis de encontrar devido à necessidade de se concentrar na profundidade correta. Focalizando os números bem impresso na parte inferior da placa de 96 poços deve ajudar. Células são mais fáceis de encontrar quando semeado pela classificador FACS pois a maioria dos poços tem uma célula.
5. Após 2 semanas, colônias de crescimento pode ser mal visto pelo olho nu, olhando para as placas de baixo. Eles são muito mais fáceis de ver sob o microscópio. Colônias tendem a crescer ao longo das bordas das colônias mais bem e normalmente em uma placa de crescer ao longo da mesma borda em poços diferentes. Mark poços com crescimento celular robusta e transferência das células para placas de 24 poços em 1 mL RPMI e retornar para a 37 ° C incubadora.
6. Manter as células em 1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁶ células / mL. Troque a mídia girando as células a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente e remover a mídia, conforme necessário. Substituir com 1 mL RPMI fresco.
7. Depois de várias days de crescimento, a transferência das células para uma placa de 6 poços e continuar crescendo em um 37 ° C incubadora.
8. Após 3 semanas, analisar os clones para a perda de IgM (como descrito abaixo).
9. Continuar a crescer as células para mais 2 semanas e depois analisar os clones novamente no ponto de tempo de 5 semanas.

6. Análise: a perda de IgM (3 semanas e 5 semanas)

1. Alíquota de 5 x 10 ⁵ células de cada poço em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e girar as células para baixo em 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. Utilização de células de cada um dos e controle de shRNA-knock-down poços, bem como uma amostra para um controle sem mácula.
2. Lave as células em 1 ml de PBS e depois girar novamente a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente.
3. Ressuspender em 50 mL de PBS (controle sem mácula) ou PBS + diluição 1:20 da PE-anticorpo marcado IgM α-humano. Incubar no gelo por 1 hora.
4. Spin the células para baixo a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente.
5. Lavar os cells duas vezes com 1 mL de PBS e girar para 400 X g por 4 minutos cada vez que a temperatura ambiente.
6. Remover o sobrenadante e ressuspender em 100 mL de PBS. Transferência de células ressuspenso manchado a um tubo FACS.
7. Analisar as células usando uma máquina FACS.
8. Compare o percentual de IgM ^- células dos controles contra o shRNA knocked-down células. Como observado anteriormente, a perda de IgM medida pelo FACS é uma medida semi-quantitativa confiável de SHM em células Ramos.

7. Análise: Confirmar knock-down por RT-PCR quantitativa (5 semanas)

1. Alíquota de 3 x 10 ⁶ células de cada poço e spin down a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente.
2. Prepare RNA a partir da alíquota de células. Usamos TRIzol de acordo com recomendações do fabricante.
3. Prepare cDNA a partir do RNA prep. Nós usamos 2 mg RNA e Sobrescrito II de acordo com recomendações do fabricante.
4. Realizar uma PCR quantitativa usando o cDNA para confirmaçãom knock-down. Usamos GAPDH como controle, normalização e do kit SYBR qPCR FAST em um volume de 10 L de reação total.

8. Análise: o seqüenciamento genômico (5 semanas)

1. Alíquota de 5 x 10 ⁶ células de cada poço e spin down a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente.
2. Isolar DNA genômico a partir dessas células. Nós usamos o Assistente de genômica SV kit de purificação de DNA de acordo com recomendações do fabricante.
3. PCR amplificar o DNA genômico para os genes Ig V ¹⁹ (Tabela 1) e quaisquer outros genes de interesse usando o KAPA DNA polimerase HiFi. Usamos essa polimerase por causa de sua baixa taxa de erros, mas qualquer de alta fidelidade da polimerase PCR deve ser aceitável.
4. Gel purificar a produtos de PCR em um gel de agarose 1% utilizando o kit de extração QIAquick gel.
5. Alguns polimerases adicionar um único resíduo de (A) desoxiadenosina para termina o 3 'dos ​​produtos de PCR, enquanto outros não. Estes 3 'A cauda são necessários para o TOPO TAetapa de clonagem. O KAPA polimerase HiFi não deixa três 'A cauda. A cauda dos produtos PCR por incubação de 25 mL de gel-purificada produto de PCR com 3 tampão de reação 10x Taq mL, 1 mL 10 mM dNTPs, e uma unidade de Taq polimerase a 72 ° C por 30 minutos.
6. Clone os produtos gel de PCR purificados usando o kit TOPO TA Cloning. Transformar os produtos da reação para o TOPO E. desde coli DH5α-T1 ^R células competentes e placa de LB / ágar placas contendo 100 mg / mL ampicilina e suplementado com 1,6 mg de X-gal de acordo com recomendações do fabricante.
7. Enviar colônias individuais para o seqüenciamento.
8. Realizar análises para determinar a seqüência de tipos e locais de mutações.

9. Resultados representativos:

Como observado anteriormente, usamos um vetor viral de controle positivo que expressa tanto GFP, bem como um gene puromicina-resistência. Se costuma ver 50-75% de células GFP ⁺ dois diasapós transfecção. Em nossa infecções, nós tipicamente ver as células 50-70% são GFP ⁺ dois dias após a infecção, mas antes da seleção. Após a seleção estiver completa,> 95% das células são ⁺ GFP.

Como experimentos representante, vamos mostrar os efeitos da superexpressão de AID ou derrubar um fator de reparo em células Ramos. Especificamente, nós transfectadas um vetor retroviral para superexpressão AID ligados através de um sítio para IRES Thy1.1 juntamente com o vetor retroviral embalagem pKat2 BOSC em 23 células. Vírus contendo-media foi filtrado e então usado para infectar as células Ramos. Ambos tipo selvagem (WT) e superexpressão AID (AID ^oi) células foram semeadas única célula e cresceu durante 3 semanas, altura em que eles foram analisadas para expressão gênica por qRT-PCR (Figura 2) e para a perda de IgM por FACS (Figura 3 ). Para a coloração FACS, as células foram incubadas com tanto diluída 1:20 PE-rotulados α-humano de anticorpos IgM, assim como 1:400 diluídos FITC marcado CD90/mouse α rat-CD90.1 (Thy1.1) de anticorpos. Em um experimento separado, contendo um ou outro um lentivírus shRNA irrelevantes (controle) ou um shRNA contra um fator de reparo de alta fidelidade DNA esperado para proteger contra SHM foram feitas em BOSC 23 células, e depois infectados em um clone de células AID ^oi Ramos. Mais uma vez, a expressão do gene (Figura 4) e perda de IgM (Figura 5) foram analisados ​​em clones única célula depois de 3 semanas. Desde que o fator de reparação é pensada para fornecer proteção contra mutações durante SHM, vemos um aumento na perda de IgM e SHM na ausência do fator. Se tivéssemos knocked-down um fator envolvido na geração de SHM mutações associadas, teríamos visto uma diminuição na perda de IgM em seu lugar.

Como esperado, a nossa qRT-PCR resultados mostram um aumento significativo na expressão AID após a infecção de células com um vetor de superexpressão AID (Figura 2), enquanto os níveis do fator de queda de reparo de DNA na presença de um shRNA dirigidas contra esse fator (Figura 4 ). Porque clon individuaises podem variar, você poderá ver alguma variação nos níveis de expressão do gene. Porque a expressão do gene pode variar, é necessário para confirmar a expressão em cada clone você está pensando em analisar mais. ShRNAs diferentes contra o mesmo gene pode ter efeitos diferentes sobre a expressão gênica, bem, então você deve tela shRNAs vários para determinar qual tem o maior impacto. Knockdown também pode ser confirmado a nível de proteínas por immunoblotting. Da mesma forma, clones individuais podem variar muito em níveis de perda de IgM. Alguns clones poderiam demonstrar um "jackpot" efeito, onde uma mutação IgM ocorreu em uma das divisões celulares mais antigos - por exemplo, você verá> perda de IgM 50%, simplesmente porque uma das células ficou IgM ^- no estágio de duas células. A influência desses clones é minimizada pelo cálculo da mediana para vários clones única célula.

Figura 1. Esquema de transinfecção perfeição, e análise de perda de IgM. Veja o texto para mais detalhes.

Figura superexpressão AID 2. Células em Ramos. WT e células AID ^oi Ramos foram clonados e única célula cultivada por três semanas, em que a expressão ponto AID em clones individuais foi medida por qRT-PCR. Expressão GAPDH foi utilizado para a normalização. WT foi definido como 1. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = <0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste.

Figura 3. Aumento da perda de IgM em células ^oi AID, em comparação com as células WT. IgM de superfície foi medida por FACS no ponto de tempo três semanas, ea porcentagem de perda de IgM foi calculado para WT e células ^oi AID. (A) Representante FACS enredo de um clone WT e um clone AID ^oi. A AID superexpressão vector tem AID ligados à Thy1.1 através de um site IRES, assim Thy1.1 expressão é usada como um substituto para a expressão AID. (B) A determinação quantitativa da perda de IgM em WT e vários clones AID ^oi. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = <0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste.

Figura 4. Knockdown de um fator de reparo em células ^oi AID. Células foram infectadas com a shRNA um controle irrelevante (controle) ou o nosso shRNA de interesse (shRNA), e única célula semeado. Após 3 semanas, expressão gênica em clones individuais foi medida por qRT-PCR. Expressão GAPDH foi utilizado para a normalização. WT foi definido como 1. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = <0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste.

Figura 5. IgM perda Maiorem células AID ^oi com níveis knocked-down de um fator de reparo. IgM de superfície em vários clones foi medido por FACS no ponto de tempo três semanas, ea porcentagem de perda de IgM foi calculado em células AID superexpressão ainda. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = <0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste.

Seqüências tabela 1 Primer para a genes de Ig ^19:. Cμ a região constante, a cadeia pesada região V (V _H), ea luz da cadeia região V (V _L).

Discussão

Como discutido anteriormente, os modelos de celular da linha de diversificação de anticorpos se tornaram um popular ponto de partida para identificar novas proteínas que influenciam diferentes etapas durante a diversificação de anticorpos. Apresentamos aqui um método para usar infecção viral às proteínas ou knock-down ou superexpressam na linha de Ramos de células B e em seguida, examinar o impacto sobre a SHM.

Para esses estudos, utilizamos tanto WT Ramos e células AID ^oi Ramos. ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
6-bem claro TC tratados com placas	Corning	3516
10 mL BD Luer-Loksyringes	BD Medical	309604
24 bem claro TC tratados com placas	Corning	3526
De 96 poços de poliestireno com fundo transparente plana TC-tratados microplacas	Corning	3596
100 milímetros TC tratados com placas de cultura	Corning	430167
Filtros de seringa Acrodisc, 0,45 mM	Pall Life Sciences	4604
Agar	Teknova	A7777
Agarose	GeneMate	E-3120-500
Ampicilina	Sigma	A0166	100 mg / mL em água
BD FACSCanto citômetro de fluxo II	BD Biosciences		ou similar
BD Falcon poliestireno rodada tubos de fundo	BD Biosciences	352054	para FACS
BOSC 23 células	ATCC	CRL-11270
Incubadora de CO 2 capazes de 37 ° C
DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle)	Sigma	D6429
FBS (soro fetal bovino)	Gémeos Bio-Products	100-106
FITC α-rato CD90/mouse CD90.1 anticorpos	BioLegend	202503	FITCα-Thy1.1
FuGENE Reagente Transfection 6	Roche	11814443001
Solução tampão HEPES	Invitrogen	15630-080
KAPA DNA polimerase HiFi	KAPA Biosystems	KK2101
LB caldo (caldo lisogenia - Luria) Pó	Difco	240230
MISSÃO TRC shRNA estoque glicerol bacteriana	Sigma		vetores shRNA
NCS (recém-nascido soro bovino)	Gémeos Bio-Products	100-504
PBS (solução tampão fosfato)	Invitrogen	70011	diluída em água para 1x
PE α-humano de anticorpos IgM	BioLegend	314508
PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solução)	Gémeos Bio-Produtos	400-110
Polibrene (Hexadimetrina brometo)	Sigma	107689	10 mg / mL em água
PureYield Sistema Midiprep Plasmid	Promega	A2495
Puromicina	Sigma	P8833	250 mcg / mL em água
QIAquick extração de gel kit	QIAGEN	28706
Ramos (RA 1) células	ATCC	CRL-1596
RPMI-1640 médio	Sigma	R8758
SuperScript II	Invitrogen	18064-022
SYBR RÁPIDO qPCR kit	KAPA Biosystems	KK4601
Taq DNA polimerase	Invitrogen	18038-042
TOPO TA Cloning kit	Invitrogen	K4520-01
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Assistente de Genomic SV sistema de purificação de DNA	Promega	A2361
X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside]	Growcells	C-5687	40 mg / mL em DMSO