Nós descrevemos um conjunto de ensaios para analisar os níveis de expressão de histonas linker H1. mRNA de genes H1 individuais são quantitativamente medido por acaso a transcrição reversa com base iniciador seguido por PCR em tempo real, enquanto que a quantificação de proteína de histonas H1 é conseguido através da análise por HPLC.
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Artigo de método
Análise de Expressão de mamíferos Linker-histona Subtipos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Histona H1 Linker liga-se à partícula núcleo nucleossomo e DNA linker, facilitando o dobramento da cromatina em estrutura de ordem superior. H1 é essencial para o desenvolvimento de mamíferos 1 e regula a expressão do gene específica in vivo 2-4. Entre as proteínas altamente conservadas histona, a família de histonas linker H1 é o grupo mais heterogénea. Existem 11 subtipos H1 em mamíferos que são diferencialmente regulados durante o desenvolvimento e em diferentes tipos celulares. Estes subtipos H1 incluem 5 somática H1s (H1a-e), o H1 substituição 0, 4 subtipos de células germinativas H1 específicos, e H1x 5. A presença de subtipos H1 múltiplas que diferem na afinidade de ligação ao ADN ea capacidade de compactação cromatina 6-9 fornece um nível adicional de modulação da função da cromatina. Assim, a análise quantitativa da expressão subtipos H1 individuais, tanto de ARNm e as proteínas, é necessário para melhor compreensão da regulação de maiorestrutura de ordem cromatina e função.
Descrevemos aqui um conjunto de ensaios concebidos para analisar os níveis de expressão dos subtipos H1 individuais (Figura 1). a expressão do mRNA de genes de variantes diferentes H1 é medido por um conjunto de altamente sensíveis e quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR), que são mais rápida, mais precisa e requerem amostras muito menos em comparação com a abordagem alternativa de análise de Northern blot. Ao contrário da maioria outras mensagens de ARNm celulares, mRNAs para os genes mais histona, incluindo a maioria dos genes H1, carecem de uma cauda poliA de comprimento, mas contêm uma estrutura de haste loop-na extremidade 3 'região não traduzida (UTR) 10. Portanto, cDNAs são preparados a partir de RNA total por transcrição inversa utilizando iniciadores aleatórios, em vez de oligo-dT iniciadores. Os ensaios em tempo real de PCR com primers específicos para cada subtipos H1 (Tabela 1) são realizados para obter medições altamente quantitativa dos níveis de mRNA de subtipo H1 indivíduos. A expressão de genes de limpeza são analisados como controlos para a normalização.
A abundância relativa de proteínas de cada subtipo H1 e histonas núcleo é obtido através de cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho (RP-HPLC) análise de histonas total extraído de células de mamíferos 11-13. O método de HPLC e as condições de eluição descrito aqui dar separações óptimas de subtipos H1 do rato. Pela quantificação do perfil de HPLC, calcula-se a proporção relativa de subtipos H1 individuais dentro da família H1, bem como determinar a H1 a razão de nucleossomas nas células.
Protocolo
1. Preparação de amostras e de extração de RNA
- Antes da extracção de RNA, todas as superfícies de trabalho e pipetas deve ser limpo com etanol a 70% e tratado com RNase solução de descontaminação, tais como a RNase Zap. Esta prática reduz as possibilidades de RNase contaminação e degradação do ARN. Usar luvas para todos os procedimentos.
- Para extrair o RNA a partir de tecido do rato, dissecar o órgão de interesse a partir do rato sacrificados, e lavar o tecido em fosfato gelada salino tamponado (PBS: 0,13 M de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, 5 mM de sódio di-hidrogenofosfato de hepta-hidrato, pH 7,4) . Proceder de imediat....
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Discussão
O conjunto de ensaios aqui apresentados permitir uma análise abrangente dos níveis de expressão de mamífero vinculador subtipos histonas. Adequadamente projetados qRT-PCR ensaios fornecem medições altamente sensível e precisa de mensagens de RNA a partir de quaisquer genes de mamíferos histona H1. A parte crítica de qRT-PCR ensaios para linker genes subtipo histona é a preparação de ADNc utilizando o iniciador aleatório baseado transcrição reversa. mRNA de genes mais histona, incluindo genes mais H1, não contêm um longo.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão GM085261 e um Cancer Coalition Geórgia Prêmio Distinguished Scholar (a FA).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Etanol absoluto | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| QI SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| Kit Mini RNeasy | Qiagen | 74104 | |
| Desoxirribonuclease I | Sigma | AMP-D1 | |
| Microseal placa de 96 poços de PCR | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Auto-colantes 'B' Microseal | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sacarose | Organics Agros | AC40594 | |
| Fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Americana Bioanalytical | AB01915 | |
| Hepta-di-hidrogenofosfato de sódio (NaH 2 PO 4 · 7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Completa Mini proteinase comprimido coquetel inibidor | Roche Applied Science | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Fluoreto de Phenylmethanesulfonyl (PMSF) | Americana Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | Americana Bioanalytical | AB01425 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hidroximetil aminometano] | Americana Bioanalytical | AB02000 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Ácido sulfúrico (H2SO4) | VWR | VW3648-3 | |
| Hidróxido de amónio (NH4OH) | Organics Agros | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrila | EMD | AX0145-1 | |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | JTBaker | 9470-01 |
Referências
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chrom....
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Reimpressões e permissões
