Summary
13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.
Abstract
חיידקים יש מסלולים מטבוליים מורכבים שניתן לחקור בשיטות הגנומיקה ביוכימיה תפקודית. אחת הטכניקות חשוב לבחון מטבוליזם התא המרכזי לגלות אנזימים חדשים היא 13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים 1. טכניקה זו מבוססת על תיוג איזוטופי, לפיה חיידקים ניזונים עם 13 ג שכותרתו מצעים. על ידי התחקות את המעבר בין הנתיבים אטום מטבוליטים ברשת ביוכימיים, אנו יכולים לקבוע מסלולים פונקציונלי לגלות אנזימים חדשים.
כפי שיטת משלים transcriptomics ו proteomics, גישות לניתוח isotopomer בסיוע של מסלולים מטבוליים מכילים שלושה שלבים עיקריים 2. ראשית, אנו לגדל תאים עם 13 ג שכותרתו מצעים. בשלב זה, את ההרכב של המדיום ואת הבחירה של מצעים שכותרתו הם שני גורמים מרכזיים. כדי למנוע רעשים מדידת פחמן הלא מסומן תוספי תזונה, מדיום מינימלי עם מקור הפחמן היחידי הנדרש. יתר על כן, הבחירה של מצע שכותרתו מבוססת על כמה יעיל זה יהיה להבהיר את מסלול להיות מנותח. בגלל האנזימים רומן לעתים קרובות כרוך stereochemistry תגובה אחרת או מוצרי ביניים, באופן כללי, מצעים פחמן שכותרתו ביחידים הם אינפורמטיבי יותר לאיתור מסלולים רומן מאלה שכותרתו אחיד לגילוי מסלולים הרומן 3, 4. שנית, אנו מנתחים את דפוסי חומצה אמינית תיוג באמצעות GC -MS. חומצות אמינו הן בשפע חלבון ולכן ניתן להשיג הידרוליזה ביומסה. חומצות אמינו ניתן derivatized על ידי N-(טרט-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) לפני ההפרדה GC. חומצות אמינו TBDMS derivatized יכול להיות מקוטעת על ידי MS והתוצאה במערכים שונים של שברים. בהתבסס על מסת יחס תשלום (m / z) של חומצות אמינו מקוטעת unfragmented, אנו יכולים להסיק את דפוסי שכותרתו אפשרית של מטבוליטים מרכזי, כי הםסימנים מקדימים של חומצות אמינו. שלישית, אנו מעברים עקבות הפחמן 13C את המסלולים המוצעים, בהתבסס על הנתונים isotopomer, לאשר מסלולים אלה הם 2 פעילים. מדידה של חומצות אמינו מספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר חיוני במטבוליזם המרכזי. אלה צמתים מרכזיים מטבולית יכול לשקף את הפונקציות של מסלולים מרכזיים הקשורים.
13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים באמצעות חומצות אמינו proteinogenic יכול להיות בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי של חילוף החומרים של חיידקים גרוע מאופיינים 1. בפרוטוקול זה, נשתמש Cyanothece 51142 כמו מאמץ את המודל להדגים את השימוש מצעים פחמן שכותרתו לגילוי פונקציות האנזימטית חדש.
Protocol
1. Cell תרבות (איור 1)
- לגדל תאים בינוניים מינימלי עם יסודות קורט, מלחים, ויטמינים, מצעים פחמן שכותרתו במפורש כי הם הטובים ביותר לחקירה מסלול. השתמש באחת צלוחיות רועד או bioreactors עבור התרבות התא. מזון אורגני, כגון תמצית שמרים, עלולה להפריע למדידת תיוג חומצת אמינו ולכן לא יכול להיות נוכח המדיום לתרבות.
- מעקב צמיחת תאים על ידי צפיפות אופטית של התרבות באורך גל אופטימלי (למשל, OD 730 עבור Cyanothece 51,142) עם ספקטרופוטומטר UV / Vis.
- תאים יכולים להיות הראשון גדל בתווך הלא מסומן. באמצע-log השלב תאים הצמיחה הם העדיפו לשמש חיסון (3% (v / v) על ידי חיסון יחס נפח) של המדיום הנקרא. תרבות שכותרתו צריכה להיות תת תרבות (3% v / v יחס חיסון) במדיום שכותרתו אותו כדי למנוע את ההקדמה של פחמן שאינם שכותרתו מ inoculum הראשונית.
class = "jove_title"> 2. חומצות אמינו מיצוי
- תת בתרבית תאים קציר (10 מ"ל) בשלב הביניים יומן הצמיחה על ידי צנטריפוגה (10 דק ', 8000 × ז).
- Resuspend גלולה ב 1.5mL של 6M HCl ולהעביר אותו בכוס ברור, פקק הברגה בקבוקון GC. שווי צלוחיות למקם אותם בתנור 100 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי hydrolyze ביומסה את החלבונים לחומצות אמינו. הידרוליזה של כדורי ביומסה יכול להניב 16 מתוך 20 חומצות אמינו נפוצה (איור 2) 5. ציסטאין טריפטופן מפורקים, ו גלוטמין ו asparagine מומרים גלוטמט aspartate, בהתאמה.
- צנטריפוגה הפתרון חומצת אמינו ב 20,000 × g עבור 5 דקות באמצעות 2 מ"ל צינורות Eppendorf, ולהעביר את supernatants על צלוחיות חדש GC. צעד זה מסיר חלקיקים מוצקים בתמיסה הידרוליזה.
- הסר את מכסי בקבוקון GC ויבש דגימות לחלוטין תחת זרם של אוויר באמצעות המדעית Thermo Reacti-VAP המאייד (הערה: מייבש להקפיא יכול לשמש גם לאo דגימות יבש). צעד זה יכול להיעשות בן לילה.
3. חומצת אמינו derivatization GC-MS התנאים
אנליזה של חומצות אמינו או טעונה / מטבוליטים מאוד קוטבי באמצעות GC מחייב מטבוליטים אלה להיות derivatized, כך חומצות אמינו הם נדיפים יכולים להיות מופרדים על ידי גז כרומטוגרפיה 2.
- ממיסים את דגימות מיובשות עם μL 150 של tetrahydrofuran (THF) ו 150 μL של N-מגיב (טרט-butyldimethylsilyl) N-methyltrifluoroacetamide-derivatization.
- דגירה כל דגימות בתנור או אמבט מים בין 65 לבין 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. וורטקס מדי פעם כדי לוודא מטבוליטים בקבוקון הם מומס.
- צנטריפוגה דגימות 20,000 × g עבור 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant על צלוחיות חדש GC. Supernatant צריך להיות פתרון ברור צהבהב. בשל הרוויה של גלאי, GC-MS דיוק המדידה יכולה להיות מושפעת conce הגבוההntration של חומצות אמינו TBDMS מוזרק derivatized (דגימות אלה לעתים קרובות מראה צבע חום כהה), ולכן, אנחנו צריכים לדלל דגימות אלה באמצעות THF לפני GC-MS מדידה 6.
- ניתוח הדגימות על ידי GC-MS (או להשתמש 01:05 01:10 יחס מפוצל, נפח הזרקה = 1 μL, המוביל גז הליום = 1.2 mL / min). השתמש בתוכנית הבאה GC טמפרטורה: להחזיק ב 150 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, להגדיל ב 3 ° C לדקה עד 280 ° C, גידול ב 20 ° C לדקה עד 300 ° C, ולאחר מכן החזק במשך 5 דקות. עיכוב מרכך ניתן להגדיר כמו 5 דקות ~ (עבור עמודה GC 30 מטר). הטווח של המוני לחייב יחס (m / z) ב-MS יכול להיות מוגדר בין 60 ל 500.
4. GC-MS ניתוח נתונים
- TBDMS חומצת אמינו derivatized המדידה יכולה להיות מושפעת גם על ידי אפליה איזוטופ בהפרדה GC. איזוטופים אור להזיז מעט מהר יותר מאשר תרומת איזוטופים בעמודה GC. כדי לצמצם את ההטיה המדידה פוטנציאל, אנו עשויים הממוצע הספקטרום המונית של כלחומצת אמינו שיא בטווח 6
- GC ו-MS ספקטרום של מטבוליטים TBDMS derivatized דווחו לפני 7. השעה השמירה GC ואת ייחודי מ '/ z פסגות עבור כל חומצת אמינו הן באיור 3.
- Derivatization של חומצות אמינו או מטבוליטים מרכזי מציגה כמויות משמעותיות של איזוטופים טבעיים שכותרתו, כולל 13 C (1.13%), 18 O (0.20%), 29 Si (4.70%), ו - 30 Si (3.09%). הרעש מדידה של איזוטופים טבעיים הספקטרום המונית גלם isotopomer ניתן לתקן באמצעות תוכנת פרסם 5, 8. הנתונים האחרונים תיוג איזוטופי מדווחים כשברים מסה, למשל, מ 0, M 1, M 2, M 3 ו M 4 (המייצגים שברים המכיל אפס עד ארבע C 13 פחמנים שכותרתו).
- מדידה של חומצות אמינו יכול לספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר מכריע: 2-אוקסו-glutarאכל, 3-P-glycerate, אצטיל-CoA, erythrose-4-P, מוחדר, phosphoenolpyruvate, pyruvate, ריבוז ו-5-P. דפוסי תיוג של מטבוליטים אלה יכולים לשמש כדי לזהות מספר מסלולים מטבוליים המרכזי (איור 2) 9. התוצאה של הניסויים תיוג ניתן לאשר המשך שימוש בשיטות ביוכימיה אחרים (למשל, RT-PCR).
5. מסלול מסומן באמצעות ניתוח נתונים חומצת אמינו
על ידי חוקרת רק חומצות אמינו כמה מפתח המופק מעוצב היטב 13 ניסויים C נותב, אנו עשויים לגלות מסלולים ייחודיים או פעילות אנזים ללא ביצוע מתוחכם 13 C-מטבולית ניתוח השטף של חילוף חומרים מרכזי כולו.
- Entner-Doudoroff מסלול: [1-13 C] גלוקוז יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, תיוג סרין יהיה נמוך משמעותית מאשר תיוג אלאנין ב 10.
- מחזור TCA הקנים: [1-13 C]pyruvate יכול לשמש כמקור פחמן. אם מחזור TCA שבור, aspartate יכול להיות מתויג על ידי שני פחמנים, בעוד גלוטמט מתויג עם פחמן אחד בלבד 11, 12.
- CO 2 קיבוע על ידי מחזור קלווין, בנסון, Bassham במטבוליזם mixotrophic: Non-CO 2 שכותרתו ומסומן מצעים פחמן הן לשמש מקורות פחמן. אם מחזור קלווין הוא פונקציונלי, סרין וסימון היסטידין יהיה מדולל באופן משמעותי, בהשוואה חומצות אמינו אחרות. שיטה כזו יכולה לקבוע את הקיבעון היחסי CO 2, כאשר מקורות פחמן אורגני נמצאים 13 בינוני.
- חמצוני מסלול pentose פוספט: [1-13 C] גלוקוז יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, אלאנין שאינו שכותרתו תהיה> 50% 12.
- מסלול Anaplerotic (למשל, PEP + CO 2 מוחדר א): 13 CO 2 ולא שכותרתו פחמן מצעים (למשל, גליצרול או pyruvate) יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, תיוג aspartate יהיה מועשר באופן משמעותי, בהשוואה אלאנין ו סרין 13.
- Re-citrate synthase: [1-13 C] pyruvate יכול לשמש כמקור פחמן. אם האנזים פעיל, גלוטמט הוא מסומן β-carboxyl קבוצה 3, 4.
- מסלול Citramalate: [1-13 C] pyruvate, [2-13 C] גליצרול, או [1-13 C] אצטט יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, כמויות תיוג לאוצין ו isoleucine זהים 14.
- סרין-isocitrate lyase מחזור: [1-13 C] pyruvate או [1-13 C] לקטט יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, פחמן העמדה השלישית סרין ותסומן 15.
- ניצול של חומרי מזון (כלומר, חומצות אמינו אקסוגניים): בינוני תרבות עם מצעים פחמן מסומן באופן מלא ולא מסומן חומצות אמינוניתן להשתמש בו. אם התאים לנצל באופן סלקטיבי חומרים אלה שאינם שכותרתו שיושלם, נוכל לראות דילול משמעותי של תוויות אלו חומצות אמינו ביומסה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תוספי תזונה אשר עדיפים על ידי התא 16.
6. נציג תוצאות
מחקרים אחרונים Bioenergy החיו אינטרסים באמצעות מיקרואורגניזמים phototrophic רומן לייצור Bioenergy ו-CO 2 ללכוד. בשנים האחרונות, מעטים 13C-מטבוליזם ניתוחים, כולל 13C-מטבולית ניתוח מתקדמים שטף (13C-MFA), הוחלו על חילוף חומרים מרכזי לחקור חיידקים phototrophic, כי ידע ביוכימי של מסלולים מטבוליים המרכזי אינו מבוסס היטב אלה שאינם מודל אורגניזמים 10, 11, 17-20. כאן, אנו מציגים דוגמה לגילוי מסלול isoleucine חלופית Cyanothece 51,142 21. ציאןothece 51142 אינו מכיל את האנזים (EC 4.3.1.19, תראונין אמוניה lyase), אשר מזרז את ההמרה של תראונין ketobutyrate-2 ב מסלול isoleucine טיפוסי סינתזה. כדי לפתור את מסלול isoleucine, אנו גדלים Cyanothece 51,142 (20 מ"ל) ב בינוני ASP2 22 עם 54 mM גליצרול (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 מנצל 2 nd עמדה שכותרתו גליצרול כמקור פחמן הראשי. אנו צופים כי תראונין ו אלאנין אחד שכותרתו פחמן, בעוד isoleucine מתויג עם שלושה פחמנים. לכן, סינתזה ב Cyanothece 51142 לא ניתן להסיק תוואי תראונין המועסקים על ידי רוב האורגניזמים (איור 4). מצד שני, לאוצין ו isoleucine יש דפוסים זהים תיוג מבוסס על קטע (M-15) + ו שבר (M-159) +. לדוגמה, הנתונים isotopomer מ [M-15] + (המכיל חומצות אמינו unfragmented) להראות תיוג זהה לאוצין (M0 = .01, M1 = 0.03, 0.21 = M2, M3 = 00.69) ו isoleucine (M0 = .01, M1 = 0.03, 0.24 = M2, M3 = 0.67). לפיכך לאוצין ו isoleucine חייב להיות סינתזה של מבשרי אותו (כלומר, pyruvate ו אצטיל-CoA). הבחנה זו עולה בקנה אחד עם המעבר פחמן שכותרתו במסלול citramalate לסינתזה isoleucine. כדי לאשר את מסלול זה, אנו לחפש במאגר הגנום המשותפת במכון ולמצוא את נוכחותו של צ 'ימה synthase citramalate (cce_0248) ב Cyanothece.
באיור 1. C-13 סייעו ניתוח צעדים מסלול.
באיור 2. חומצות אמינו המשמשים לרכישת דפוס תיוג של מבשרי המטבולית שלהם. ACoA, אצטיל-CoA, AKG, α-Ketoglutarate; C5P, ריבוז 5 פוספט: CIT, ציטראט; E4P, erythrose 4-פוספט; G6P, גלוקוז 6 פוספט; OAA, מוחדר;, PEP phosphoenolpyruvate, PGA, 3-phosphoglycerate; PYR, pyruvate.
באיור 3. פסגות GC עבור 16 חומצות אמינו. חומצות אמינו TBDMS derivatized סדוקים ידי MS לשני קטעים: (M-57) +, המכיל את כל חומצות האמינו, ו (M-159) +, אשר חסר את הקבוצה carboxyl α של חומצה אמינית. עבור לאוצין ו isoleucine, + (M-57) היתה חפיפה על ידי פסגות המוני אחרים. אנו ממליצים להשתמש שבר (M-15) + לנתח את תיוג כל חומצת אמינו. הקבוצה (f302) + מזוהה חומצות אמינו ביותר, אשר מכיל רק את הראשון (α-carboxyl הקבוצה) ו פחמנים השני השדרה חומצת אמינו. כי זה שיא MS לעתים קרובות יש רעש גבוה ל-אות יחס, (f302) + לא מומלץ כמותי וניתוח והנתיבים מטבולית 7.
igure 4 "/>
איור 4. תיוג מעברים במסלולים isoleucine ב Cyanothece 51,142 (שונה מנייר הקודמת שלנו) 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה כולל האכלה את התא עם המצע שכותרתו למדידת דפוסי כתוצאה תיוג איזוטופי של חומצות אמינו באמצעות GC-MS. מאז MS הנתונים (m / z יחסי) לתת בדיוק את הכמות הכוללת של תיוג של יונים MS, אנחנו צריכים להעריך את הפצות isotopomer של חומצות אמינו על ידי בחינת מ '/ z יחס של שני unfragmented (M-57) + וחומצות אמינו מקוטעת (כלומר, (M-159) + ו (f302) +). יתר על כן, אנו יכולים לבצע תרביות תאים עם מספר בינוני זהים מבחינה כימית אך מצעים כי יש דפוסים שונים תיוג (1 עמדה שכותרתו רחוב, 2 nd עמדה שכותרתו וכו '). מידע על תיוג מטבוליטים מניסויים אלה יכולים להיות משולבים כדי לפענח את נתיבי המעבר בפועל פחמן דרך מסלולים מטבוליים המרכזית.
ניתוח מסלול, הבחירה של מצע שכותרתו היא חשובה. באופן כללי, מצעים פחמן שכותרתו ביחידים הם EASier להשתמש במעקב אחר גורלם של פחמן שכותרתו כאשר 13 C מחלחלים דרך מסלולים מרכזיים, ואילו פחמן מרובות שכותרתו מצעים עשויים לבלבל פחמן מעקב. כמו כן, מצעים שכותרתו ביחידות הם יותר אינפורמטיבי להבהיר המבנים מולקולה ייחודית מטבוליטים מאשר מצעים שכותרתו אחיד. 4 לדוגמה, synthase (Re) מסוג ציטרט מראה stereochemistry תגובה שונה synthase ציטראט נורמלי, ובכך גורם ציטראט יש כירליות מולקולריים שונים . מצד שני, הם מצעים שונים התאמתם לזהות מסלולים הקשורים בהם. גלוקוז הוא הטוב ביותר עבור גילוי יחס הפיצול בין הגליקוליזה לבין המסלולים פוספט pentose, בעוד pyruvate או אצטט הם הטובים ביותר לניתוח מחזור TCA וכמה מסלולים חומצת אמינו. לכן, יש צורך להשתמש מצעים שונים כדי לחקור את התמונה הכוללת של חילוף החומרים בתא.
13 C-איזוטופתיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מסלולים תפקודית מיקרואורגניזמים. עם זאת, טכניקה זו יש מספר מגבלות. ראשית, היא מתאימה רק עבור ניתוח של חילוף החומרים של פחמן באמצעות מצעים אורגניים, כפי שהוא לא יכול לפתור ישירות חילוף החומרים חילוף חומרים autotrophic אם CO 2 משמש כמקור פחמן יחיד. Autotrophic תרבויות באמצעות CO 2 התווית את כל חומצות האמינו באותה מידה כמו 12 קלט CO תערובת 13/02 CO 2 23. זה עושה ניתוח מסלול קשה, כמו ניתוח חילוף החומרים יש להסיק התארגנות של 13 פחמנים C ב מטבוליטים של מסלולים מטבוליים שונים. שנית, מאמר זה מציג תוצאות איכותיות אך ורק להפלות בין "פעיל" או "לא פעיל" מסלולים. כימות מדויק של חילוף החומרים דורש גישה מודלים מתוחכמים (כלומר,
לבסוף, מספר גדל והולך של רצפי הגנום שאינם מודל מינים של חיידקים מתפרסמים בכל שנה. עם זאת, אפיון פונקציונאלי של מינים אלה מפגרת הרחק מאחור בקצב של רצף הגנום. 13 C-תיוג הגישות יכול לשחק תפקידים חשובים אישור וגילוי של מסלולים מטבוליים שאינם מודל אורגניזמים רבים. יתר על כן, המידע תיוג יכול להיות משולב עם מודלים מטבולית (13 C-MFA) והנתיבים כדי לפענח מוחלט פחמן מיקרואורגניזמים 25. לכן, טכניקה זו יכולה להיות בשימוש נרחב בניתוח מערכות ביולוגיות הקשורות דלק ביולוגי, ecologiCal רפואי יישומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק קריירה NSF (MCB0954016) לבין מחקר Bioenergy DOE גרנט (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | - |
| GC Columns | J&W Scientific | DB5 (30m) | - |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TS-18825 | For drying amino acid samples |
References
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C.
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).
- Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U.
