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Artigo de método

Melhoramento de Indução apoptose e autofagia por um sintético C-1 Novel Analogue, de 7 de deoxypancratistatin em adenocarcinoma de mama humano e células de neuroblastoma com tamoxifeno

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DOI:

10.3791/3586

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30 de maio de 2012

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 2Chemistry Department and Centre for Biotechnology, Brock University

Neste artigo

Resumo

Temos sintetizado um análogo romance de pancratistatin com atividade anti-câncer comparável como pancratistatin nativa; curiosamente, o tratamento com tamoxifeno combinatória rendeu uma drástica melhoria na indução de apoptose e autofagia por mitocôndria com efeito mínimo sobre os fibroblastos não cancerosos. Assim, JCTH-4 em combinação com o tamoxifen poderia proporcionar uma terapia anti-cancro segura.

Resumo

O câncer de mama é um dos cânceres mais comuns entre as mulheres na América do Norte. Muitos dos atuais tratamentos anti-câncer, incluindo a radiação ionizante, através de induzir a apoptose danos ao DNA. Infelizmente, tais tratamentos são não-selectivos para as células cancerosas e produzir toxicidade semelhante em células normais. Relatamos indução selectiva da apoptose em células cancerosas pela pancratistatin composto natural (PST). Recentemente, um novo análogo de PST, um derivado de C-1 acetoximetil de 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), foi produzido por síntese de novo e exibe actividade indutora comparável selectiva apoptose em diversas linhagens de células cancerosas. Recentemente, autofagia tem sido implicado em doenças malignas como tanto pró-sobrevivência e os mecanismos de pró-morte em resposta à quimioterapia. O tamoxifeno (TAM) tem demonstrado, invariavelmente, a indução de pró-sobrevivência autofagia em inúmeros cânceres. Neste estudo, a eficácia da JCTH-4 isoladamente e em combinação com a TAM para induzir a morte celular em significância da mama humanor (MCF7) e neuroblastoma (SH-SY5Y) células foi avaliada. TAM sozinho induzida autofagia, mas a morte de células insignificante enquanto JCTH-4 sozinho causou indução significativa da apoptose com alguma indução de autofagia. Curiosamente, o tratamento combinatória produziu um aumento drástico na indução de apoptose e autofágica. Foram monitoradas a dependentes do tempo alterações morfológicas em células MCF7 submetidos a TAM induzida por autofagia, JCTH-4-induzida apoptose e autofagia e morte celular acelerada com o tratamento combinatório usando microscopia de lapso de tempo. Nós demonstramos que estes compostos para induzir a apoptose / autofagia por direccionamento mitocondrial nestas células cancerosas. É importante ressaltar que estes tratamentos não afetaram a sobrevivência dos não cancerosos fibroblastos humanos. Assim, estes resultados indicam que JCTH-4 em combinação com a TAM poderia ser utilizado como uma forma segura e muito potente terapia anti-cancro contra o cancro da mama e células de neuroblastoma.

Protocolo

Introdução

A apoptose, ou do tipo I morte celular programada, é um processo fisiológico que pode operar extrinsecamente, via ligação de um ligando de morte a um receptor de morte, ou intrinsecamente. A via intrínseca da apoptose é iniciada pelo stress intracelular, tais como danos no ADN e disfunção mitocondrial, o que conduz finalmente ao permeabilização da dissipação, mitocôndrias do potencial da membrana mitocondrial (MMP), a libertação de factores apoptogénica a partir do espaço intermembranar mitocondrial, e posterior execução de apoptose 1.

Autofagia é um processo no qual uma célula pausas, degrada, e recicla seus próprios componentes intracelulares, mantendo a integridade da membrana plasmática, que é desencadeada por diferentes tipos de tensões celulares, incluindo o stress oxidativo, hipóxia, agregados de proteínas, privação de nutrientes, privação de factor de crescimento, e organelas danificadas 2. Nas fases iniciaisdeste processo, material citosólica é tragado por autofagossomas, duplo-membranados vesículas, que fundem a lisossomos para formar autolysosomes. Mensagem fusão dos lisossomos, materiais citosólicas anteriormente ocupados por autofagossomas são degradados por enzimas lisossomais 2. Activação extensa desta via produz degradação extensiva de componentes intracelulares, que podem conduzir à morte celular autofágica ou tipo II a morte celular programada 3.

Evasão de morte celular tem sido considerada uma das marcas de câncer 4. O cancro é uma doença caracterizada pelo crescimento celular descontrolado e proliferação 5. Em particular, neuroblastoma surge a partir de desenvolvimento de células nervosas do sistema nervoso simpático a partir da crista neural 6. É o tumor sólido mais comum que ocorre em crianças pequenas, que representam cerca de 9% de todos os cânceres infantis 7. Embora muito progresso tem sido feito até à data, esta doença continua a ser problemáticopara ambos os cientistas básicos e clínicos. Por outro lado, o cancro da mama é o cancro mais comum entre as fêmeas 8. O tamoxifeno (TAM) tem sido freqüentemente utilizado para a terapia de cânceres hormônio-sensíveis do peito como um receptor de estrógeno (ER) antagonista 9. No entanto, outros relatórios fornecem evidências de outros mecanismos independentes de indução de apoptose pela TAM. Em particular, a TAM interage com Complexo I da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) na sua mononucleótido flavina (FMN) local 10.

H é um composto natural isolado a partir da planta littoralis Hymenocallis. Contrastando a partir de muitos agentes quimioterapêuticos actualmente em utilização, tem sido mostrado para induzir a apoptose, de uma forma não-genotóxico, de forma selectiva em vários tipos de células cancerosas através mitocondrial segmentação 11-15. No entanto, o trabalho pré-clínico e clínico tem sido dificultada pela sua disponibilidade, ela está presente em quantidades muito baixas em sua fonte natural e complic muitosções fardo sua síntese química. Temos sintetizados e testados análogos sintéticos do 7-deoxypancratistatin e observou actividade anti-cancro de um derivado semelhante em C-1 acetoximetilo, JC-TH-acetato-4 (JCTH-4) 16. Temos agora em mãos um análogo PST sintético com atividade anti-câncer potente. Sua síntese foi padronizado e pode ser escalado para produzir quantidades suficientes para o trabalho pré-clínico e clínico. Uma vez que PST natural e TAM tanto alvo a mitocôndria, seria interessante para investigar o efeito combinado de um análogo sintético de PST no cancro da mama humano e células de neuroblastoma em combinação com a TAM.

Relata-se a citotoxicidade seletiva de JCTH-4, em neuroblastoma humano (SH-SY5Y) e adenocarcinoma de mama (MCF7) células. JCTH-4 foi capaz de induzir a apoptose em ambas as linhas celulares por direccionamento mitocondrial; JCTH-4 causada dissipação de MMP e um aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS) produção em isolado mitochondria a partir destas células cancerosas. Além disso, autofagia foi induzida por JCTH-4 em células MCF7. Curiosamente, a adição de TAM para JCTH-4 insulto melhorada os efeitos acima mencionados de JCTH-4 em SH-SY5Y e células MCF7. As alterações morfológicas induzidas pela JCTH-4 e TAM sozinho e em combinação, em células MCF7 foram monitorizados através de lapso de tempo de microscopia de contraste de fase ou imagens de campo claro. Humanos normais fibroblastos fetais (NFF) exibiram uma diminuição acentuada na sensibilidade à JCTH-4, tanto isoladamente e em combinação com a TAM. Portanto, estas observações sugerem JCTH-4, sozinho e com TAM, ser um agente eficaz e segura quimioterapêutico contra o cancro da mama e neuroblastoma.

Materiais e Métodos

1. Cultura de Células

  1. Crescer e cultura SH-SY5Y células de neuroblastoma humanas (ATCC, Cat. EUA No. CRL-2266, Manassas, VA), com meio de Dulbecco Eagles Modificado F-12 de HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) suplementado com 2 mM L-glutaminaE, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10 mg / ml de gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá). Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Crescer e cultura das células MCF7 mama humanos adenocarcinoma (ATCC, Cat. No. HTB-22, Manassas, VA, EUA) em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canadá, Mississauga, ON, Canadá) suplementado com 10% de FBS padrão (Thermo Scientific, Waltham, MA) e 10 mg / mL de gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá). Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
  3. Crescer e cultura aparentemente normal de fibroblastos fetal humana (NFF) linha celular (Coriell Institute for Medical Research, Cat. No. AG04431B, Camden, NJ, EUA), em meio Dulbecco modificado por Eagle, glicose elevada (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA ) suplementado com 15% de FBS e 10 mg / mL de gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá). Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2.

2. Preparação de drogas

  1. Pesar tamoxifeno (TAM citrato) sal (Sigma-Aldrich, Cat. No. T9262, Mississauga, ON, Canadá) e dissolvê-lo em DMSO para preparar uma solução-mãe 10 mM. Solução de loja estoque a -20 ° C até à utilização. Todos os controlos de veículo utilizado neste estudo continham DMSO a menos de 0,5%.
  2. Repetir o passo 2,1 para preparar uma solução-mãe 1 mM dissolvido em DMSO de JC-TH-acetato-4 (JCTH-4), produzida por síntese a partir de chemoenzymatic bromobenzeno como descrito anteriormente 16. Solução de loja estoque a -20 ° C até à utilização. Todos os controlos de veículo utilizado neste estudo continham DMSO a menos de 0,5%.

3. Time-Lapse Microscopy

  1. Placa de aproximadamente 2,0 x 10 5 células MCF7 em 35 mm de vidro de fundo pratos de cultura (MatTek Corporation, Cat. No. P35G-014-C, Ashland, MA, EUA) em condições estéreis, de um armário de classe II biossegurança e permitir-lhes a crescer a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Quando as células atingem confluência 60 a 70%, tratá-los com 1 uM JCTH-4 usando um 1 mMsolução stock dissolvido em DMSO e 10 uM TAM usando uma solução de estoque 10 mM dissolvido em DMSO, isoladamente e em combinação, em uma classe II biossegurança armário.
  3. Após o tratamento de células durante 48 horas, as células realizado numa câmara aquecida a 37 ° C com 5% de CO 2 em uma fase de um DMI6000 Leica microscópio fluorescente (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).
  4. Usando LAS software AF6000, definir o microscópio de contraste de fase para tomar ou micrografias de campo brilhante com uma ampliação de 400x a cada 5 minutos durante 18 horas.

4. Coloração nuclear

  1. Placa de aproximadamente 2,0 x 10 5 MCF7 ou SH-SY5Y células em cada poço de uma placa de fundo bem claro 6 de cultura de tecido em um classe II biossegurança armário e permitir-lhes a crescer a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Quando as células atingem confluência 60 a 70%, tratá-los com 1 uM JCTH-4 usando uma solução stock a 1 mM dissolvido em DMSO e 10 uM TAM usando uma solução de estoque 10 mM dissolvido em DMSO, de ambos ossozinho e em combinação, em uma classe II biossegurança armário.
  3. Incubar as células com os tratamentos acima mencionados, a 37 ° C e 5% de CO2 durante 48 horas (SH-SY5Y células) ou 72 horas (células MCF7).
  4. Após tratamento e incubação de células com as drogas, adicionar directamente Hoechst 33342 corante (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) para os meios de comunicação das células tratadas para uma concentração final de 10 uM para corar os núcleos.
  5. Incubar as células com o corante Hoechst durante 5 a 10 minutos protegidas da luz.
  6. Coloque a placa no palco de um IRB DM Leica microscópio invertido de fluorescência (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).
  7. Tome micrografias fluorescentes e em fase de ampliação de 400x.

5. A anexina V ensaio de ligação

  1. Placa de aproximadamente 5,0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y, ou células NFF em 10 ml de placas de cultura de tecidos em uma classe II biossegurança armário e permitir-lhes a crescer a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Wcélulas de galinha atingir confluência 60 a 70%, tratá-los com 1 uM JCTH-4 usando uma solução stock a 1 mM dissolvido em DMSO e 10 uM TAM utilizando uma solução-mãe 10 mM dissolvido em DMSO, tanto isoladamente como em combinação, em uma classe II biossegurança gabinete.
  3. Incubar as células com os tratamentos acima mencionados, a 37 ° C e 5% de CO2 durante 48 horas (SH-SY5Y células) ou 72 horas (MCF7 e as células NFF).
  4. Preparar tampão de anexina V obrigatório em ddH2O com 10 mM de HEPES, 10 mM de NaOH, 140 mM de NaCl, e 1 mM de CaCl2, pH 7,6 e armazenar a 4 ° C até à utilização.
  5. Após o tratamento e incubação de células com drogas, remova a mídia a partir das placas contendo células em suspensão e colocá-lo em um tubo separado 15 ml cônico para cada grupo de tratamento diferente marcado com o tratamento adequado.
  6. Retire a partir de células aderentes nas placas utilizando tripsina.
  7. Após as células levantada a partir do prato, como um resultado da tripsina, aspirar os meios colocados no 15 mL cónicaal tubo no passo 5,4 e colocá-lo de volta em seus pratos originais com as células de tripsina em suspensão.
  8. Com o enchimento da pipeta eletrônica e pipetas sorológicas, misture os meios de comunicação com a solução de célula de tripsina e coloque esta mistura de volta para os correspondentes 15 ml tubos cônicos.
  9. Centrifugar as células a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, remover o sobrenadante de cada tubo, e Ressuspender as células em PBS.
  10. Centrifugar as células a 600 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante de cada tubo, e Ressuspender as células em tubos de microcentrífuga rotulado com 50 a 70 ul de tampão de anexina V de ligação.
  11. Adicionar anexina V AlexaFluor-488 (01:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) e Hoechst corante para uma concentração final de 10 uM e incubar durante 15 minutos protegidas da luz.
  12. Após a incubação, vórtice um dos tubos de microcentrífuga, adicionar 7-10 uL da mistura de células para uma lâmina de microscópio, colocar um overtop lamela da mistura de células na Microscopdeslizantes e, bem como ter micrografias fluorescentes, tanto anexina V e Hoechst imagens para cada ponto de vista, com uma ampliação de 400x em um IRB DM Leica microscópio de fluorescência invertido (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). Repetir para cada amostra experimental em cada um dos tubos de microcentrífuga restantes.

6. Água sal de tetrazólio solúvel (WST-1) Análise da viabilidade celular

  1. Trypsinize um balão T75 confluentes ou 10 cm prato de cultura de tecidos de MCF7, SH-SY5Y, ou células NFF em uma classe II biossegurança armário.
  2. Após as células terem sido levantado, adicionam-se 5 a 10 mL de meios de comunicação para a tripsina e colocar a suspensão de células media em um tubo de 15 mL cónico.
  3. Centrifugar as células a 600 xg durante 5 minutos, colocar o tubo de volta para o armário de segurança biológica, remover o sobrenadante de cada tubo, e ressuspender as células em cerca de 1 a 3 mL de meios, dependendo do tamanho sedimento celular.
  4. UL lugar 10 de suspensão de células em um tubo de microcentrífuga, adicionam-se 10 ul de corante Trypan Blue (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá), e misture com uma micropipeta.
  5. Carregar 10 uL de células Trypan Blue suspenso em um hemocitómetro (Hausser Scientific, EUA), a contagem das células, e calcular a concentração de células da suspensão de células no original 15 mL tubo cónico.
  6. Use esta concentração para determinar o volume de suspensão de células original é necessária para criar as suspensões de células diluídas com concentrações de 1,5 x 10 5 células / mL para MCF7 e SH-SY5Y e 5,0 x 10 4 para as células NFF necessários para o plaqueamento.
  7. Use as suspensões de células diluídas para placa de 15 x 10 3 MCF7 ou SH-SY5Y células / poço ou 5,0 x 10 3 células NFF / poço pela adição de 100 uL das suspensões de células diluídas a cada poço de uma placa de fundo 96 clara bem cultura de tecidos. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite.
  8. Tratar as células com 1 mM JCTH-4 e 10 da TAM mM tanto isoladamente e em combinação na classe II biossegurança armário para 72 horass para MCF7 e as células NFF, e durante 48 horas para SH-SY5Y células.
  9. Após tratamento e incubação da droga, adicionar 10 uL de WST-1 de reagente (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) a cada poço e incubar a placa durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  10. Fazer leituras de absorbância a 450 nm em um Victor Wallac 3 1420 Multilabel Contador (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canadá) e expressá-las como percentagens dos grupos de controlo com solvente.

7. Tetrametilrodamina éster metílico de coloração (TMRM)

  1. Colocar a lamela em cada poço de uma placa de fundo bem claro 6 de cultura de tecidos e placa de células MCF7 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços em uma classe armário biossegurança II. Permitir-lhes a crescer a 37 CO ° C e 5% 2.
  2. Quando as células atingem confluência 60 a 70%, tratá-los com 1 uM JCTH-4 usando uma solução stock a 1 mM dissolvido em DMSO e 10 uM TAM usando uma solução de estoque 10 mM dissolvido em DMSO,tanto sozinhos como em combinação, em uma classe II biossegurança armário.
  3. Incubar as células com os tratamentos acima mencionados, a 37 ° C e 5% de CO2 durante 72 horas.
  4. Após tratamento e incubação de células com as drogas, adicionar directamente Hoechst 33342 corante (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) para os meios de comunicação das células tratadas para uma concentração final de 10 uM para corar os núcleos, bem como éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá) a uma concentração final de 200 nM.
  5. Incubar as células com os corantes em 5% de CO2 e 37 ° C durante 45 minutos protegidas da luz.
  6. Pipetar 8 dos meios de comunicação ou PBS para uma lâmina de microscópio e tomar uma lamela a partir da placa de 6 poços e colocá-lo na parte superior dos meios de comunicação ou de PBS na lâmina de microscópio com as células virados para baixo, com uma pinça.
  7. Tome micrografias fluorescentes, ambos da Hoechst e micrografias TMRM de cada exibição, com uma Leica DM IRB microscópio invertido de fluorescência (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) com ampliação de 400x.

8. Isolamento Mitocondrial

  1. Prepare cerca de 10 mL de tampão hipotónico (1 mM de EDTA, 5 mM de Tris-HCl, 210 mM de manitol, 70 mM de sacarose, 10 mM Leu-pep, 10 uM Pep-A, e 100 mM de PMSF) e tampão de reacção e manter as duas soluções em gelo.
  2. Com cerca de 8-10 confluentes T75 frascos de cultura de tecidos de SH-SY5Y células, as células trypsinize, adicionar meios para neutralizar a tripsina, recolher as suspensões de células em 50 mL tubos cónicos, e centrifugar os tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
  3. Remover os sedimentos celulares sobrenadante e ressuspender em cerca de 10 a 20 mL de PBS frio, centrifugar os tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, e repetir este processo de lavagem uma vez.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em tampão hipotónico frio. Homogeneizar células manualmente com um moinho de tecido de vidro e centrifugar o lisado de células a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
  5. Centrifugar o sobrenadante resultante a 15.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante citosólica e ressuspender o sedimento mitocondrial em tampão de reacção frio.

9. Amplex Ensaio Vermelha

  1. Após o isolamento a partir de células mitocôndrias, estimar a concentração de proteína da amostra de mitocôndrias isoladas usando uma curva padrão de concentrações conhecidas de 1mg/mL BSA (albumina de soro bovino) com o ensaio de proteína BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA EUA) .
  2. Usando a concentração estimada de proteína da solução isolado mitocôndrias, calcular o volume desta solução para dar 20 mg de proteína. Pipetar este volume em cada poço de uma placa de 96 poços opaca para carregar 20 mg de proteína / poço.
  3. Encher cada poço na placa para um volume total de 100 uL com tampão de reacção, o tratamento medicamentoso (com uma concentração final de 1 uM JCTH-4, e / ou 10 uM TAM, ou 250 uM de PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , Canada), utilizado como um controlo positivo), reagente Amplex Red a uma concentração final de 50 uM, e peroxidase de rábano (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) na proporção de 6 uL U/200.
  4. Após uma incubação de 2 horas, fazer leituras de fluorescência em Ex. 560 nm e EM. 590 nm sobre um espectrofluorímetro (XPS Spectramax Gemini, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

10. Preparação lisado celular

  1. Células MCF7 crescer até à confluência 60 a 70% em 10 cm placas de cultura de tecidos.
  2. Tratar as células com 1 uM JCTH-4 e 10 uM TAM isoladamente e em combinação, durante 72 horas com cerca de 10 a 15 pratos por grupo de tratamento.
  3. Preparar tampão de lise celular (10 mM Tris-HCl a pH 7,2, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1% de Triton-X-100; 10 mM Leu-pep, 10 uM Pep-A, e 100 mM de PMSF ) e armazenamento a 4 ° C até à utilização.
  4. Mecanicamente desalojar as células a partir das superfícies da placa com um raspador de células e recolher células em 50 marcadotubos ml.
  5. Centrifugar os tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, remover os sedimentos celulares sobrenadante e ressuspender em cerca de 10 a 20 mL de PBS frio, de centrifugação os tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, e repetir este processo de lavagem uma vez.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em tampão frio de células de lise. Homogeneizar células manualmente com um moinho de tecido de vidro e centrifugar o lisado de células a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
  7. Descartar os peletes e armazenar os lisados ​​de células à temperatura de -20 ° C até à utilização.

11. Ocidentais Análises Blot

  1. Determinar a concentração de proteína de lisados ​​de células usando o ensaio de proteína BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA EUA). Sujeitar as amostras de proteína a SDS-PAGE e da proteína de transferência para uma membrana de nitrocelulose.
  2. Após a transferência, as membranas de bloco com um w 5% / leite v TBST (Tris-salino tamponado Tween-20) solução durante 1 hora.
  3. Membranas de sonda com uma formigai-LC3 anticorpo criado em coelhos (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No. NB100-2220, Littleton, CO, EUA), ou um anticorpo anti-β-Actina levantado em rato (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. No. sc-81.178, Paso Robles, CA, EUA) durante a noite a 4 ° C.
  4. Membranas sujeitas a um minuto 15 e duas lavagens 5 minutos em TBST e incubar com um anti-rato (1:2000), ou um coelho anti-(1:2000) de rábano anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Abcam, Cat. No. ab6728 e ab6802, Cambridge, MA, EUA) durante 1 hora a 4 ° C.
  5. Membranas sujeitas a três lavagens consecutivas de 5 minutos em TBST e visualizar bandas de proteínas com o reagente de quimioluminescência reforçada (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canadá).
  6. Realizadas análises de densitometria usando software ImageJ.

12. Monodansylcadaverine coloração (MDC)

  1. Colocar a lamela em cada poço de uma placa de fundo bem claro 6 de cultura de tecidos e placa de células MCF7 em cada poço de uma 6bem claro fundo placa de cultura de tecidos em uma classe II biossegurança gabinete. Permitir-lhes a crescer a 37 CO ° C e 5% 2.
  2. Quando as células atingem confluência 60 a 70%, tratá-los com 1 uM JCTH-4 usando uma solução stock a 1 mM dissolvido em DMSO e 10 uM TAM utilizando uma solução-mãe 10 mM dissolvido em DMSO, tanto isoladamente como em combinação, em uma classe II biossegurança gabinete.
  3. Incubar as células com os tratamentos acima mencionados, a 37 ° C e 5% de CO2 durante 72 horas.
  4. Após tratamento e incubação de células com drogas, adicionar directamente Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) para uma concentração final de 0,1 mM a cada poço durante 15 min.
  5. Incubar as células com o corante, a 5% de CO2 e 37 ° C durante 15 minutos protegidas da luz.
  6. Pipetar 30 dos meios de comunicação ou PBS para uma lâmina de microscópio e tomar uma lamela a partir da placa de 6 poços e colocá-lo na parte superior dos meios de comunicação ou de PBS na lâmina de microscópio com a FACI célulasng para baixo com uma pinça.
  7. Tome fluorescente MDC e micrografias de fase, para cada ponto de vista, com uma Leica DM IRB invertidos microscópio de fluorescência (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) com ampliação de 400x.

13. Os resultados representativos

Indução seletiva da apoptose em adenocarcinoma de mama humano e células de neuroblastoma por JCTH-4: Valorização do Ativo pela TAM

Indução seletiva da apoptose foi demonstrada em células cancerosas por várias natural, PST (Fig. 1a) 11-13. Devido à baixa disponibilidade de PST, foram sintetisados ​​de 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, a fig. 1b) e peneirada-los para a actividade anti-cancro semelhante em adenocarcinoma de mama humano (MCF7) e células de neuroblastoma (SH-SY5Y). Na primeira fase de experiências, nós quisemos para monitorizar as alterações morfológicas ao longo do tempo após o tratamento com JCTH-4 e TAM sozinho e em combinação, em MCF7 células. Células MCF7 foram monitorizados durante 18 horas, como se vê na vídeo produzido por um lapso de tempo de microscopia de contraste de fase com imagens, com o tratamento com solvente (controlo) durante 48 horas; estas células não exibiram alterações significativas na morfologia. Em contraste, após 48 horas de 1 uM tratamento JCTH-4, estas células exibiram alterações morfológicas associadas com a apoptose, tais como o encolhimento, blebbing, formação de corpo como se vê na apoptótica do vídeo 2. Por outro lado, o tratamento TAM sozinho em células MCF7 produzida uma morfologia muito distinta incluindo inclusões puntiformes indicativos de autofagossomas associados com autofagia (Video 3). Muito mínima morfologia apoptótica foi observada e células exibiram geralmente morfologia saudável comparável ao controlo de solvente tratada células MCF7. Curiosamente, na presença de TAM, a indução de apoptose por JCTH-4 foi drasticamente aumentada, tal como indicado pela morfologia apoptótica aumentada em células MCF7 após 48 horas como illustrated em vídeo 4.

Na segunda fase de experiências foram utilizados corantes fluorescentes para avaliar a indução de apoptose. Após 72 horas e 48 horas de um tratamento iM-4 JCTH em MCF7 e SH-SY5Y células, respectivamente, Hoechst corante foi utilizado para monitorizar e morfologia nuclear. Os resultados indicaram núcleos, condensado brilhantemente coradas acompanhada por corpos apoptóticos em MCF7 e SH-SY5Y células, indicativos da indução de apoptose (Fig. 2a, b). Tratamento TAM sozinha rendeu morfologia apoptótica mínimo nuclear em MCF7 e SH-SY5Y células; núcleos eram grandes, redondos e vagamente coradas com Hoechst comparável ao grupo controle solvente (Fig. 2a, b). De acordo com o vídeo 4, os núcleos de MCF7 e SH-SY5Y células exibido um aumento acentuado na morfologia apoptótica com o tratamento de combinação após 72 horas (Fig. 2a, b).

Para verificar a indução de apoptose, as células foram avaliadas quanto à pexternalização hosphatidylserine, um marcador para a apoptose, através de um ensaio de V anexina ligação 17. Células MCF7 e SH-SY5Y tratada durante 72 horas e 48 horas, respectivamente, com 1 mM JCTH-4 sozinho e em combinação com 10 uM TAM foram positivas para aderência à anexina V, indicado pela fluorescência verde, confirmando a indução de apoptose (Fig. 3a, b ). N externalização evidente de fosfatidilserina foi observada em MCF7 e SH-SY5Y células tratadas com TAM sozinho, bem como em células NFF tratados com todos os grupos acima mencionados tratamentos após 72 horas (Fig. 3c). Portanto, JCTH-4 isoladamente e em combinação com a TAM selectivamente induz a apoptose em MCF7 e SH-SY5Y células.

Para quantificar o efeito de JCTH-4 isoladamente e em combinação com a TAM, um WST-1 ensaio colorimétrico baseado para a viabilidade celular, um indicador do metabolismo celular activa, foi realizada em MCF7 e as células NFF tratada durante 72 horas e SH-SY5Y células tratadas durante 48 horas.Em comparação com os grupos de controlo de solvente, 1 uM JCTH-4 diminuição do metabolismo celular activa por mais de 50%, enquanto que 10 uM TAM sozinho exibiram nenhuma diferença significativa em ambos MCF7 e SH-SY5Y células (Fig. 4a, b). Curiosamente em MCF7 e SH-SY5Y células, a adição de TAM para JCTH-4 insulto resultou numa diminuição sinérgica no metabolismo celular. Células NFF eram drasticamente menos sensível a ambos JCTH-4 sozinho e JCTH-4 com a TAM (Fig. 4c). Assim, JCTH-4 demonstra uma atividade sinérgica seletiva com a TAM em MCF7 e SH-SY5Y células.

Mitocôndria de JCTH-4

Para ver se JCTH-4 tem como alvo a mitocôndria para induzir a apoptose potencial de membrana mitocondrial em células inteiras e geração de ROS em mitocôndrias isoladas foi monitorada. MCF7 células foram tratadas durante 72 horas e coradas com TMRM. 1 uM JCTH-4 diminuiu MMP, indicado pela perda de fluorescência vermelha (Fig. 5a). No entanto, com thadição e de 10 uM TAM, uma maior dissipação de MMP foi observada, enquanto que 10 uM TAM sozinho não teve qualquer efeito evidente no MMP.

Como aumenta geração de ROS têm sido associadas a permeabilização da membrana mitocondrial e indução de apoptose, a produção de ROS foi avaliada com Amplex corante vermelho na mitocôndria isolado a partir de SH-SY5Y células tratadas com 1 uM JCTH-4 e 10 uM TAM, isoladamente e em combinação 18 -20. As leituras de fluorescência foram expressos como unidades relativas de fluorescência (RFU). Aumentos na ROS geração foram observados com JCTH-4 e TAM sozinho (Fig. 5b). Curiosamente, tratamento de combinação proporcionou um maior aumento da produção de ROS. Um indutor bem conhecida de produção de ROS na mitocôndria, PQ, foi utilizado como um controlo positivo.

Indução de autofagia por JCTH-4 e TAM

Indução autofágica tem sido associada ao insulto quimioterapêutico por muitos compostos diferentes 3. Para avaliar a indução de autofagia, a coloração MDC foi realizada em células MCF7 tratados com 1 uM JCTH-4 e 10 uM TAM isoladamente e em combinação durante 72 horas. Fluorescência ponteada azul, indicativa de autofagossomas, estava presente em células MCF7 tratados com JCTH-4 e TAM isoladamente e em combinação (Fig. 6a). Notavelmente, a intensidade de coloração MDC foi maior com o tratamento de combinação, seguido pela TAM sozinho, e JCTH-4 sozinho.

Durante autofagia, microtúbulo proteína associada cadeia leve 1 3 (LC3), normalmente situado no citosol (LC3-I), é lipidated com fosfatidiletanolamina e, subsequentemente, localizada às membranas autophagosomal (LC3-II) 2. Para verificar a indução de autofagia, os níveis de LC3-II foram avaliados em células MCF7 tratados durante 72 horas através de análises de Western blot. 1 uM JCTH-4 ligeiramente induzida a conversão de LC3-I para LC3-II, enquanto 10 TAM uM produziu uma resposta maior autofágica (Fig.6b). Curiosamente, o tratamento combinação resultou em maior indução de autofagia, obtendo-se um LC3-II a LC3-I proporção maior do que 3. Portanto, estes resultados demonstram a indução autofágica em células MCF7 por JCTH-4 e TAM isoladamente e em combinação, com a maior resposta em células com o tratamento de combinação.

Suplementar Video 1. Morfologia celular de MCF7 células tratadas com controle de solvente. MCF7 células foram monitorados entre 48 e 66 horas de tratamento de controle pós-solvente (DMSO), utilizando time-lapse com imagens de microscopia de contraste de fase. As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO 2. As imagens foram capturadas em aumento de 400x. Clique aqui para assistir ao vídeo .

Suplementar vídeo 2. Indução da morfologia celular apoptótica em células MCF7 tratados com JCTH-4. MCF7 células foram monitorados entre 48 e 66 horas sagacidade pós-tratamentoh 1 mM JCTH-4 usando time-lapse com imagens de microscopia de contraste de fase. As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO 2. As imagens foram capturadas em aumento de 400x. Clique aqui para assistir ao vídeo .

Suplementar Video 3. Indução da morfologia celular autofágica em MCF7 células tratadas com a TAM. MCF7 células foram monitorados entre 48 e 66 horas após o tratamento com 10 mM TAM usando time-lapse com imagens de microscopia de contraste de fase. As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO 2. As imagens foram capturadas em aumento de 400x. Clique aqui para assistir ao vídeo .

Suplementar Video 4. Morfologia apoptótica reforçada por JCTH-4 com a TAM em MCF7 células. MCF7 células foram monitorados entre 48 e 66 horas após o tratamento com ambos mM 1 JCTH-4 e 10 mM TAM usando microscopia de lapso de tempo com a fase contimagens Rast. As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO 2. As imagens foram capturadas em aumento de 400x. Clique aqui para assistir ao vídeo .

figure-protocol-1
Figura 1. Comparação estrutural de PST para um análogo 7-desoxi sintético. (A) a estrutura química de pancratistatin (PST). (B) a estrutura química de JC-TH-acetato-4 (JCTH-4).

figure-protocol-2
Figura 2. JCTH-4 induz apoptose morfologia nuclear com atividade melhorada com a TAM. Morfologia nuclear de (a) MCF7 e (b) SH-SY5Y células tratadas durante 72 horas e 48 horas, respectivamente, com as concentrações indicadas de TAM e JCTH-4 coradas com corante Hoechst. Os grupos de controlo foram tratados com solvente (DMSO). As imagens foram tomadas com uma ampliação de 400x em um microscópio de fluorescência. Barra de escala = 15 mm.

figure-protocol-3
Figura 3. JCTH-4 causas fosfatidilserina externalização isoladamente e em combinação com a TAM selectivamente nas células cancerosas. A anexina V ligação a fosfatidilserina exteriorizada foi avaliada para verificar a indução da indução da apoptose em (a) MCF7 (72 horas), (b) SH-SY5Y (48 horas), e (c) NFF (72 horas), as células tratadas com JCTH-4 e TAM nas concentrações indicadas. Os grupos de controlo foram tratados com solvente (DMSO). As imagens foram tomadas com uma ampliação de 400x em um microscópio de fluorescência. Barra de escala = 15 mm.

figure-protocol-4
TAM Figura 4. Aumenta diminuição viabilidade até JCTH-4 selectivamente nas células cancerosas. Placas de 96 poços foram semeadas with (a) MCF7, (b) SH-SY5Y, e as células (c) NFF e tratada com JCTH-4 e TAM nas concentrações indicadas. MCF7 e as células foram tratadas NFF durante 72 horas e SH-SY5Y foram tratados durante 48 horas. Adicione o tratamento de drogas e de incubação, WST-1 reagente foi adicionado a cada poço, e as leituras de absorvância foram levados a 450 nm e expressa como uma percentagem do controlo (DMSO). As estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism versão 5.0. Os valores são expressos como média ± DP de quadruplica de 3 experimentos independentes. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 versus controle; # p <0,05 versus 1 mM JCTH-4; † p <0,0001 TAM versus 10 mM. SH-SY5Y: * p <0,0005 versus controle; # p <0,005 versus 1 mM JCTH-4; † p <0,005 mM TAM versus 10. NFF: * p <0,005 mM TAM contra 10 + 1 mM JCTH-4 em células MCF7; # p <0,01 versus 10 TAM mM + 1 mM JCTH-4 em SH-SY5Y células.

figure-protocol-5
Figura 5. JCTH-4 e ato TAM na mitocôndria. (A) MCF7 células foram cultivadas em lamelas e tratado com as concentrações indicadas de drogas por 72 horas e coradas com TMRM para avaliar MMP. As células do grupo de controlo foram tratados com solvente (DMSO). As imagens foram capturadas com uma ampliação de 400x em um microscópio de fluorescência. Barra de escala = 15 uM. (B) mitocôndrias isoladas a partir de SH-SY5Y células foram tratadas com JCTH-4 e TAM nas concentrações indicadas e produção de ROS foi avaliada com o substrato Amplex Red na presença de peroxidase de rábano (HRP). As células do grupo de controlo foram tratados com solvente (DMSO). O paraquat (PQ) foi utilizado a uma concentração de 250 uM como um controlo positivo. As leituras de fluorescência foram obtidos após 2 horas de tratamento em Ex. 560 nm e EM. 590 nm e expressa como fluorescenc relativaunidades de eletrônicos (RFU). As estatísticas foram obtidas através dos programas GraphPad Prism versão 5.0. Dados são representativos de 3 experiências independentes com tendências semelhantes. Os valores são expressos como média ± SD de quadruplica de 1 experiência independente. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,001 versus controle; # p <0,05 versus 1 mM JCTH-4; † p TAM mM <0,05 versus 10; @ p <0,05 versus 250 mM PQ.

figure-protocol-6
A Figura 6 TAM. Aumenta a indução de autofágica JCTH-4. (A) MCF7 células foram cultivadas em lamelas e submetido a JCTH-4 e TAM insulto nas concentrações indicadas durante 72 horas. Células do grupo de controlo foram tratados com solvente (DMSO). Adicione o tratamento, MCF7 células foram coradas com MDC para detectar vacúolos autofágicos. As imagens foram capturadas com uma ampliação de 400x em um microscópio de fluorescência. Barra de escala = 15 mm. (b) As análises de Western blot foram realizadas para LC3 e β-Actina em lisados ​​de células de MCF7 células tratadas com as concentrações indicadas de drogas por 72 horas. Análises densitométricas foram executados usando o software ImageJ. As estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism versão 5.0. Os valores são expressos como média ± DP. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 versus controle; # p <0,001 versus 1 mM JCTH-4; † p <0,001 mM TAM versus 10.

Lista de abreviaturas.

ER receptor de estrógeno
FMN mononucleótido flavina
JCTH-4 JC-TH-acetato-4
LC3 microtúbulo proteína associada cadeia leve 1 3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrpotencial de membrana ial
MRC cadeia respiratória mitocondrial
NFF fibroblasto humano fetal normal
PQ paraquat
PST pancratistatin
RFU relativos unidades de fluorescência
ROS espécies reativas de oxigênio
TAM tamoxifeno
TMRM tetrametilrodamina éster metílico

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Discussão

Os compostos de PST e semelhantes têm sido demonstrado que têm propriedades anti-cancro 11-15,21. Nós apresentamos previamente PST natural para desestabilizar a mitocôndria seletivamente nas células cancerosas, que assim induz a apoptose pela liberação de fatores de apoptogénica 12,14. É mais provável que JCTH-4 actua através do mesmo mecanismo; JCTH-4 Fig. causada colapso MMP em células MCF7 como visto com coloração TMRM (Fig. 5a), e aumentou geração de ROS na mit...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Cavaleiros de Colombo Capítulo 9671 (Windsor, Ontário), e um CIHR Frederick Banting e Best Charles Canadá Bolsa de Pós-Graduação concedido a Dennis Ma. Obrigado a Robert Hodge e Elizabeth Fidalgo da Silva por sua ajuda com a microscopia de lapso de tempo. Obrigado a Katie Facecchia para editar os vídeos de lapso de tempo de microscopia. Gostaríamos também de agradecer Sudipa junho Chatterjee e Phillip Tremblay, pela revisão crítica deste manuscrito. Este trabalho é dedicado em memória de Kevin Couvillon que perdeu a batalha contra o câncer em 2010.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do material Companhia Número de catálogo
SH-SY5Y linha celular ATCC CRL-2266
Modificação de Dulbecco Eagles Médio F-12 de HAM Sigma-Aldrich 51448C
Soro fetal de bovino Gibco BRL 16000-044
MCF7 linha celular ATCC HTB-22
Meio RPMI-1640 Sigma-Aldrich R 0883
Aparentemente normal, linha celular humana fetal fibroblastos (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Meio Dulbecco modificado por Eagle, médio de glucose elevada Thermo Scientific SH30022.01
Tamoxifen sal citrato Sigma-Aldrich T9262
35 mm de vidro de cultura pratos de fundo MatTek P35G-014-C
Leica DMI6000 microscópio invertido B Leica Microsystems N / A
Hoechst 33342 corante Molecular Probes H3570
Leica DM IRB invertidos microscópio de fluorescência Leica Microsystems N / A
A anexina V-488 AlexaFluor Invitrogen A13201
Trypan solução azul Sigma-Aldrich T8154-20ML
Hemocitómetro Fisher Scientific 267110
WST-1 reagente Roche Applied Science 11644807001
Wallac Victor 3 1420 Multilabel Contador PerkinElmer 1420-011
Tetrametilrodamina metil éster (TMRM) Gibco BRL T-668
Moedor de tecido de vidro Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad ensaio de proteína Bio-Rad Laboratories 500-0001Bottom da Forma
Amplex Vermelho Invitrogen A12222
Peroxidase de rábano (HRP) Sigma-Aldrich P8125
Spectramax Gêmeos XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 anticorpo criado em coelhos Novus Biologicals NB100-2220
Anticorpo anti-rato conjugado com HRP secundária Abcam ab6728
Anticorpo anti-coelho conjugado com HRP secundária Abcam ab6802
Substrato de peroxidase de quimioluminescência Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

Referências

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