Neste relatório nós descrevemos um método para esmagamento do nervo ciático do rato. Este método usa prontamente disponíveis pinça hemostática e facilmente reproduzível e produz esmagamento do nervo ciático completa. Além disso, nós descrevemos um método para preparar montagens de músculos inteiros adequados para análise da regeneração do nervo após esmagamento do nervo ciático.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Regeneração do sistema nervoso periférico (SNP) é amplamente estudada tanto pela sua importância para as doenças humanas e para entender a resposta robusta regenerativo montado pelos neurônios do SNP, assim, possivelmente, iluminando as falhas do CNS regeneração 1. Esmagamento do nervo ciático (axoniotmese) é um dos modelos mais comuns de lesão do nervo periférico em roedores 2. Esmagamento interrompe todos os axônios, mas Schwann lâminas de células basais são preservados para que a regeneração é ideal 3,4. Isto permite que o investigador para estudar precisamente a capacidade de um axónio crescente para interagir com tanto a célula de Schwann e as lâminas basais 4. Ratos foram geralmente os modelos animais preferidos para esmagamento do nervo experimental. Eles são amplamente disponíveis e seu nervo lesado fornece uma aproximação razoável das lesões nervosas humanas 5,4. Embora menor em tamanho do que rato nervo, o nervo do mouse tem muitas qualidades semelhantes. Mais importante, porém, mousmodelos E são cada vez mais valiosa porque a grande disponibilidade de linhas transgénicas permite agora uma dissecção detalhada das moléculas individuais críticos para a regeneração do nervo 6, 7. Antes investigadores usaram vários métodos para produzir uma queda ou lesão do nervo, incluindo simples fórceps, pinças anguladas refrigerados, pinças hemostáticas, braçadeiras e fixações, vasculares, investigador-concebidas 8,9,10,11,12. Os pesquisadores também utilizaram vários métodos para marcar o local da lesão, incluindo sutura, partículas de carbono e partículas fluorescentes 13,14,1. Nós descrevemos o nosso método para obter um esmagamento do nervo ciático reprodutivelmente completa com precisão e persistente marcação do local de esmagamento utilizando uma pinça fina hemostáticos e carbono subsequente esmagamento do local de marcação. Como parte de nossa descrição do procedimento de esmagamento do nervo ciático incluímos também um método relativamente simples de montar todo músculo que usamos para quantificar a regeneração posteriormente.
Protocolo
1. Sujeitos animais
1,1. Tratamento
- Todos os procedimentos com animais deve ser realizada com a aprovação do modelo assistencial local Animal e Comitê de Ética e de acordo com o uso ea Comissão e os Institutos Nacionais da Saúde, com as medidas tomadas para minimizar a dor e desconforto.
- Os nossos ratinhos foram alojados sob condições controladas de temperatura sobre uma luz reversa de 12 horas e ciclo escuro, enquanto alimentados rato Chow e água ad libitum.
- Para os estudos de regeneração adulto, os ratinhos deve ser de pelo menos 6 semanas de idade, quando o esmagamento do nervo ciático é executada. Esta époc....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Nós apresentamos um método para obter um esmagamento do nervo ciático confiável completa com marcação precisa do local do esmagamento. Como mencionado anteriormente, esmagamento do nervo ciático é um modelo comum de lesão do nervo periférico em ratinhos e ratos. Apesar de cada método de esmagamento tem as suas vantagens e desvantagens, encontramos este método produziu uma queda completa que foi facilmente marcado com um mínimo de equipamento especial (por exemplo, braçadeiras especiais, etc).
M.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede K08NS065157 (a TAF) Além disso, o Centro Penn para lesões músculo-esqueléticas, P30AR050950 Prêmio Número do Instituto Nacional de Artrite, Doenças músculo-esqueléticas e da pele apoiaram este trabalho (TAF e Steven S. Scherer). Finalmente, Shriners Pediatric Research financiamento semente Center (TAF) apoiaram este trabalho. Nós gostaríamos de agradecer o Dr. Young-Jin Son inicialmente para demonstrar todo o processo de montagem e Amy A. Kim por sua ajuda na produção dos desenhos da Figura 1.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome (descrição / quantidade) | Fornecedor | Número de Catálogo | |
| Clipper Mini com No. 0000 Lâmina | Roboz | RC-5903 | |
| Nair Depilação (9 oz.) | Igreja e Dwight Co., Inc. | N / A | |
| Scrub Betadine Cirúrgica (1 galão) | Fisher Scientific | 19066452 | |
| Pomada oftálmica (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Os instrumentos cirúrgicos:
| Nome (descrição / quantidade) | Fornecedor | Número de Catálogo |
|---|---|---|
| FST 250 Hot talão esterilizador | Belas Ferramentas Ciência | 18000-45 |
| Iris Tesoura (11 cm de comprimento) | Instrumentos de precisão do mundo | 500216 |
| Potts-Smith Fórceps (Straight; 18 centímetros; 1x2 Dentes) | Belas Ferramentas Ciência | 11024-18 |
| McPherson Vannas-Tesoura (5 lâminas mm) | Instrumentos de precisão do mundo | 14.124-G |
| Dumont # 5 - Fórceps Dumoxel Padrão Dica | Belas Ferramentas Ciência | 11252-30 |
| Dumont # 5/45 - Fórceps Dumoxel Padrão Dica | Belas Ferramentas Ciência | 11251-35 |
| Ultra hemostats Belas (em linha reta; superfícies internas lisas) | Belas Ferramentas Ciência | 13020-12 |
| Carbono activado em pó (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Tamanho 6-0 com C-1 Agulha (Silk, estéril, Preto, Trançado,Não-absorvível; 18 "Comprimento; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-1011 |
| Reflex Aplicador Clip (para 9 clipes mm) | Instrumentos de precisão do mundo | 500345 |
| 9mm aço inoxidável Clipes de Reflexos (100/box) | Instrumentos de precisão do mundo | 500346 |
Animal Care:
| Nome (descrição / quantidade) | Fornecedor | Número de Catálogo |
|---|---|---|
| 0,9% de cloreto de sódio (Conservante livre; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Sistema completo Blanket homeotérmicos com sonda flexível (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Platfor cirúrgicom e Afastadores:
(Comprado em loja de ferragens local)
| Nome (descrição /) | Quantidade |
|---|---|
| Inoxidável plataforma de aço (moído; ~ 12 "x12" x1 / 8 ") | 1 |
| Ímãs Button (Exemplo: Eclipse E825) | 3 |
| Parafusos de aço inoxidável (3 "Long; diâmetro determinado pelo imã Button) | 3 |
| Porcas de aço inoxidável (sob medida para caber Bolts) | 9 |
| Bandas de borracha (tensão leve) | 3 |
| Pinos de insetos (ambos os extremos dobrados para formar Ganchos) | 3 |
Semi-Thins:
| Nome (descrição / quantidade) | Fornecedor </ Strong> | Número de Catálogo |
|---|---|---|
| Paraformaldeído (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Fosfato de Sódio Dibásico anidro (500 g; utilizado para preparar tampão fosfato) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Fosfato de sódio monobásico anidro (1 kg; usado para preparar tampão fosfato) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| O glutaraldeído (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Tetróxido de ósmio (aquoso a 4%, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Óxido de propileno (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Incorporar 812 (Kit, para os blocos rígidos / alto contraste de imagem) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine azul (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Preparação muscular de todo o monte e Imuno-histoquímica:
| Nome (descrição / quantidade) | Fornecedor | Número de Catálogo |
|---|---|---|
| Paraformaldeído (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Fosfato de Sódio Dibásico anidro (500 g; utilizado para preparar tampão fosfato) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Fosfato de sódio monobásico anidro (1 kg; usado para preparar tampão fosfato) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% de BSA Diluente Solução / bloqueio (200 mL) | Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glicina, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (acórdão de 12, 4 garrafas de oz) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 Kit lb) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Pinos de aço inoxidável de insetos, Tamanho 1 (100/pkg) | Belas Ferramentas Ciência | 26001-40 |
| Tetrametilrodamina-A-bungarotoxina (0,5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Anticorpo monoclonal de ratinho contra a SMI-312 (0,1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Anticorpo monoclonal de ratinho contra o SV2 (0,1 mL) | Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Coelho PolyAnticorpo contra clonal GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein de cabra conjugado IgG anti-ratinho, Fcy subclasse 1 específico | Jackson ImmunoResearch | 11 5-095-205 |
| DyLight 649 Conjugado de burro anti-IgG de coelho | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Meio de Montagem Vectashield (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Além disso Superfrost Lâminas de Microscopia (branco, Tamanho: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Óculos Fisherfinest Premium Cover (Tamanho: 40 x 22 mm; Pack de 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
Referências
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
