Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.
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Artigo de método
A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células de Purkinje são um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento dendrítico, porque têm uma árvore dendrítica impressionante, que é estritamente orientadas no plano sagital e desenvolve principalmente no período pós-natal, em pequenos roedores 3. Além disso, os anticorpos que estão disponíveis várias células de etiquetas selectiva e intensa de Purkinje, incluindo todos os processos, com anti-calbindina D28K sendo a mais amplamente utilizada. Para visualização dos dendritos em células vivas, os camundongos que expressam EGFP seletivamente nas células de Purkinje 11 estão disponíveis através Jackson laboratórios. Organotípicas culturas de células cerebelares fatia permitir a manipulação experimental fácil de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas, porque a maior parte da expansão da árvore dendrítica de células dendríticas Purkinje realmente está ocorrendo durante o período de cultivo 4. Apresentamos aqui um protocolo curto, confiável e fácil de visualizar e analisar a morfologia dendrítica de células de Purkinje crescido em organotypic cerebelares culturas fatia. Para muitos fins, uma avaliação quantitativa da árvore dendrítica célula de Purkinje é desejável. Nós nos focamos em dois parâmetros, o tamanho da árvore dendrítica e números de ponto de desvio, que pode ser rápida e facilmente determinados a partir de anti-calbindina manchadas culturas fatia do cerebelo. Estes dois parâmetros produzir uma medida fiável e sensível de mudanças da árvore de Purkinje de células dendríticas. Utilizando o exemplo de tratamentos com a proteína-quinase C (PKC) e PMA activador do receptor de glutamato metabotrópicos 1 (mGluR1) é mostrado como as diferenças no desenvolvimento dendríticas são visualizadas e quantitativamente avaliados. A combinação de a presença de uma árvore dendrítica extensa, métodos selectivos e imunorreatividade intensa, as culturas organotípicas de fatias que cobrem o período de crescimento dendrítico e um modelo de rato com Purkinje expressão EGFP célula específica tornar as células de Purkinje de um sistema poderoso modelo para revelar os mecanismos de dendritic desenvolvimento.
Protocolo
1. Criação de culturas organotípicas cerebelo
Cultura de lâminas cerebelares são preparadas a partir de 8 dias pós-natal filhotes P (8) do rato utilizando o método de incubação estática 10. Em nosso laboratório, nós usamos B6CF1 ratos. Em algumas experiências ratinhos transgénicos também foram utilizadas as quais expressam EGFP selectivamente nas células de Purkinje. A preparação de culturas fatia demora cerca de 30 minutos por rato filhote, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Todos os passos são realizados sob condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar, com instrumentos cirúrgicos esterilizados. <....
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Discussão
Os métodos aqui apresentados permitem estudar Purkinje desenvolvimento de células dendríticas em culturas organotípicas do cerebelo e avaliar quantitativamente a expansão de células dendríticas Purkinje, medindo o tamanho da árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação dendríticas. Naturalmente, uma análise mais completa e quantitativas sofisticadas de dendrites de células de Purkinje é possível, por exemplo, através da determinação comprimento dendrítico total, realizando uma análise de Sholl ou determinação d.......
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Divulgações
Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva Europeia Conselho Comunidades, de 24 de Novembro de 1986 (86/609/CEE) e foram analisados e autorizados pelas autoridades suíças. Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, eo Swiss National Science Foundation (31003A-116624).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Insere cultura de tecidos | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | Os PICMORG50 pastilhas têm uma borda baixa e permitir a exibição de culturas vivas em um microscópio |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Águia | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Soro de cavalo | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Forbol 12-myristate 13-acetato (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS) -3,5-di-hidroxi-fenil-glicina (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Coelho anti-calbindina D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Coelho anti-GFP | Abcam | Ab290 |
Referências
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J.
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Reimpressões e permissões
