Silk Sistema de Cultura de Cinema para In vitro Análise e Desenho Biomaterial

Resumo

Filmes de seda são uma nova classe de biomateriais facilmente personalizáveis ​​para uma vasta gama de aplicações biomédicas. O sistema de cultura de seda apresentado filme é altamente adaptável a uma variedade de In vitro Análises. Este sistema representa uma oferta de plataforma biomaterial projeto In vitro Otimização antes de tradução direta para In vivo Modelos.

Resumo

Películas de seda são promissores proteína à base de biomateriais que podem ser fabricadas com alta fidelidade e economicamente dentro de um ambiente de investigação ^1,2 laboratório. Estes materiais são desejáveis ​​porque possuem altamente controlável características dimensionais e material, são biocompatíveis e promover a adesão celular, pode ser modificado através de padronização topográfica ou pela alteração química de superfície, e pode ser usado como um depósito para as moléculas biologicamente activas para aplicações de entrega de drogas relacionados ^3-8. Além disso, as películas de seda são relativamente simples de design personalizado, pode ser concebido para dissolver dentro de minutos ou degradar ao longo do ano, in vitro ou in vivo, e são produzir com o benefício adicional de ser transparente na natureza e, portanto, altamente adequado para aplicações de imagiologia ^{9 - 13.} A metodologia de sistema de cultura aqui apresentada representa uma abordagem escalável para avaliações rápidas de células-seda superfície do filmeinterações. De particular interesse é a utilização de películas de superfície de seda estampados para estudar as diferenças na proliferação celular e respostas das células para o alinhamento ^12,14. As culturas semeadas foram cultivadas em dois micro-padronizado e substratos filme plano de seda, e, em seguida, avaliados através de lapso de tempo de imagens de contraste de fase, microscopia eletrônica de varredura e avaliação bioquímica da atividade metabólica e teor de ácido nucléico. Em resumo, o filme de seda sistema in vitro de cultura oferece uma configuração customizável experimental adequado para o estudo da superfície celular interacções sobre um substrato biomaterial, que podem então ser optimizadas e, em seguida, traduzido a modelos in vivo. Observações utilizando o sistema de cultura aqui apresentados estão actualmente a ser utilizada para auxiliar em aplicações que variam de interacções de células básicas para concepção de dispositivos médicos, e, portanto, são relevantes para uma ampla gama de campos biomédicas.

Protocolo

1. Fabricação de moldes de borracha de silicone

1. Produzir ou comprar uma superfície topográfica desejada para a fundição. Para esta publicação um padrão 100 milímetros bolacha de silício gravado será descrito (Figura 1).
2. Pesar polidimetilsiloxano (PDMS) envasamento (componente A) e catalisador de solução (componente B) numa proporção de 01:09 (9 g envasamento e 1 g de catalisador), como fornecido com o kit comprado.
3. Misture soluções completamente para iniciar o processo de cura.
4. O local de superfície bolacha de silício dentro de um prato de fundição.
5. Pesar 4,5 g de solução de PDMS para bolacha de silício.
6. Dispersão da solução PDMS forma a cobrir uma área de 100 mm de diâmetro da superfície da bolacha.
7. Incline bolacha para espalhar uniformemente solução PDMS.
8. Cubra bolacha com 100 mm de diâmetro tampa prato de petri.
9. Local de instalação de fundição em forno de 60 ° C durante a noite, fazendo certo que a cura está ocorrendo em uma superfície plana.
10. Lugar curado PDMS / silício bolacha em etanol a 70%banho antes da remoção.
11. Comece removendo PDMS de wafer usando lâmina de barbear para levantar borda (circunferência inteira) primeiro.
12. Puxe delicadamente PDMS fora de usar uma pinça dentro de um banho de etanol 70% tomando cuidado para não rasgar silicone fundição de borracha.
13. Punch Out moldes individuais de PDMS utilizando 14 furador mm. Este diâmetro é concebido para encaixar uma configuração placa de 24 cavidades.

2. Produção de solução de seda

1. Traga 2 L de água destilada _(dH2O) a uma fervura dentro de um copo de vidro de ^7.
2. Corte 5 g de casulos de Bombyx mori-da-seda em terços.
3. Descarte de casulos amplamente contaminadas como indicado pela excessiva revestimento de partículas de insetos na superfície interior do casulo.
4. Medir 4,24 g de carbonato de sódio.
5. Adicionar carbonato de sódio lentamente até à ebulição dH ₂ volume de O para evitar a ebulição ao longo de água, e permitir a dissolução completa antes de prosseguir.
6. Adicione os pedaços de casulo para dH ebulição _{2 O durante 40 min., e usar um Teflon barra de agitação revestida a agitar casulos durante o processo de ebulição.}
7. Após a fervura, escorra cuidadosamente dH ₂ O na pia e ressoar com o extrato de seda com as mãos para remover o excesso de água.
8. Lavar seda extrair três vezes durante 20 min. cada em 1 L de dH ₂ O em um copo de laboratório, e usar uma barra de agitação para circular volume dentro copo.
9. Após lavagem, o anel de fora do extracto de seda com a mão e extracto lugar da fibra de seda dentro de uma capa química para permitir a secagem para um hr 12. período.
10. No dia seguinte, pesar as fibras de seda secos, que normalmente é ~ 3,5 g: ___________-g
11. Preparar solução de 9,3 M LiBr para uma solução a 20% w / v de seda. Utilize seguintes equações para calcular o peso necessário e volumes:
    1. (Peso de seda extracto a partir do passo 10) x (4) = ___________ mL de solução total de 9,3 M LiBr
    2. [(807,705) x (LiBr volume a partir da peça 11.a)] / 1000 = ___________ g de LiBr para adicionar à _de dH2O
12. Adicionar peso LiBr medido num copo de vidro da seguinte dH volume de O _2:
    1. (0,8) x (volume calculado a partir do passo 11.a) = ___________ mL de _dH2O
13. Verter desta solução para um tamanho apropriado cilindro graduado, e trazer solução até ao volume final tal como calculado em parte 11.a.
14. Coloque o extrato de seda em copo e despeje solução LiBr sobre as fibras de seda certificando-se as fibras de seda estão imersos dentro de solução LiBr usando uma espátula de laboratório.
15. Coloque a seda dissolvido em 60 ° C forno durante 4 hr:
    Hora de início: ___________
    Fim tempo: ___________
16. Utilizando uma seringa de tamanho adequado elaborar 12 mL da solução de seda. Coloque uma agulha de 18G no final da seringa, e então injetar a solução em um cassete de diálise (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Após o enchimento da cassete, extrair o ar restante para fora da cassete com a seringa esvaziado.
17. Local ficassete de diálise preencheram dentro de 1 L de dH ₂ O.
18. Alterar dH ₂ volume de O após 1 h, 4 h, 8 h, e em seguida cada hr 12 3x para um total de 6 alterações:
    1. Begin: ___________
    2. 1h: ___________
    3. 4h: ___________
    4. 8 horas: ___________
    5. 12 horas: ___________
    6. 12 horas: ___________
    7. 12 horas: ___________
    8. End: ___________
19. Após a diálise, lentamente recolher a solução de seda a partir de cassetes com seringa. Solução lugar em 10.000 g tubos de centrífuga de classificação.
20. Centrifugar a solução duas vezes a 10.000 g, a 4 ° C durante 20 min cada. Depois de cada sobrenadante da centrifugação lugar para um novo tubo.
21. Armazenar a Solução de seda thr em 4 ° C geladeira.
22. Pipetar 2 amostras de 0,5 ml em solução de seda prato pesar pequeno, eo local pesar pratos dentro de um forno de 60 ° C seco durante 12 horas ou até a secagem da solução de seda.
23. Pesar o filme de seda restante sólido a partir de botamostras h para medir seda por cento em peso de solução de concentração de proteína volume:
    1. Peso da combinadas 2 amostras de seda filmes: ___________ mg
    2. (Peso da 23.a) x (100) de seda = ___________%

3. Preparação de filmes de seda e Configuração do Sistema Cultura

1. Preparar as superfícies de fundição de PDMS com a limpeza com fita adesiva transparente para remover a poeira.
2. Limpeza PDMS substratos por imersão em EtOH a 70% e lavar três vezes com _dH2O
3. O local de 14 mm de PDMS moldes na placa de suporte, que é tipicamente uma tampa placa de 24 poços.
4. Para produzir uma película 50 mm de espessura, espalhar 70 μls de solução de seda 8%, em moldes de PDMS, utilizando uma ferramenta de líquido derramado que é tipicamente um seringa de 1 mL ponta ^2.
5. Permitir que as películas de seda para secar a descoberto em um banco limpo executando uma pressão de fluxo de ar de 150 Pa durante um período de 90 min ou até que os filmes são seco.
6. Uma vez que os filmes são lugar seco conjunto de filmes inteiro, incluindo PDMS midade, para uma câmara de água-recozimento durante mais de 4 horas para produzir um filme insolúvel em água. Isto é tipicamente de uma câmara de exsicador vazio com água no fundo da bacia puxado a um vácuo 25 ¹⁵ kPa.
7. Remover filmes de seda de água-de recozimento de câmara e lugar para uma bancada limpa.
8. Preparar um banho de EtOH a 70% dentro de uma placa de Petri de 35 mm, e substratos local de controlo (isto é, vidro ou superfícies plásticas) e anéis de aço inoxidável dentro dos poços durante pelo menos 10 min para esterilizar.
9. Remover filmes a partir de moldes de seda de PDMS, utilizando fórceps, mergulhar-los em EtOH 70%, e em lugar de amostra de 24 poços da placa pré-preenchido com 1 mL de EtOH 70%, tornando lado modelado certeza está virada para cima para permitir a adesão celular.
10. Após a colocação de cada amostra de película de seda em alguns correspondentes bem lugar pesos de aço inoxidável de anel (11,65 mm de diâmetro interior, 15,45 mm de diâmetro exterior, e 1,18 mm de espessura) no topo.
11. Permitir que as amostras com anéis a incubar durante 10 minutos para assegurar a esterilidade.
12. Remove EtOH e lavar 3x com cada amostra de 1 mL de PBS. Deixe cada lavagem sentar-se por 5 min para permitir a difusão completa.
13. Remover PBS usando pipeta de vidro de aspiração, assegurando ao mesmo tempo para remover maioria de bolhas sob amostras de filmes de seda.
14. Prepare linha de células para a semeadura. Como um exemplo, trypsinize humano córneo-limbo linha celular epitelial (HCLE) com tripsina a 0,25% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de solução para 7 min. Desactivar tripsina utilizando 1:1 de volume de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) meios de comunicação de passagem com FBS 10%, adicionada. Centrifugar tripsinizadas células HCLE, adicionar 8 mL de queratinócitos de soro meios de comunicação livres (K-SFM) de pellet celular, agitar suavemente para dispersar HCLEs, e gerar contagem de células.
15. UL de amostra 500 da suspensão HCLE por poço usando tipicamente um 10.000 células / cm ² de densidade.
16. Culturas lugar dentro da incubadora, a 37 ° C e 5% de CO ₂ e executar desejado protocolo experimental.

4. Os resultados representativos

Figura Fluxograma 1. Ilustrando resumida processo de 10 etapas da produção de seda filme e preparação do sistema de cultura.

Figura 2. (A) de matriz 21-corante de topografias de linha estampados superfície produzida sobre uma bolacha de silício 90 mm ​​de diâmetro empregando técnicas padrão de condicionamento de fotolitografia e seco. (B), os filmes de seda manter características originais da linha paralelas estampados, após a fundição em superfícies de moldagem de PDMS. (C) desenho esquemático tamanho demonstrando recurso escolhido para promover o alinhamento celular. (D) Seção transversal de filme de seda ilustrando retido superfície e paralelo alinhado padronizado.

Figura 3. Scanning micrografias electrónicas de linha de células HCLE aderindo a (A) modeladoe (B), os filmes de seda planas em dia 2 de cultura. Culturas HCLE continuam a proliferar até à confluência em (C) modelado e (D) por superfícies planas dia 8 em cultura.

Figura 4. (A, D, G) e modelado (B, E, H) filmes de seda planas cultura HCLE células comparativamente a (C, F, I) substratos de controlo de vidro em (AC) dias 1, (DF) dias 4, e 8 dias (GI) em cultura. (J) do teor de ácido nucleico CyQuant e (K) (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) os dados da actividade metabólica de ensaio que demonstram a viabilidade HCLE em ambos modelado e substratos de película plana de seda quando comparado com as superfícies de vidro de controlo ao longo do tempo (barras de escala = 100 mm).

Vídeo 1. Lapso de tempo imagens de contraste de fase de células que migram HCLE sobre uma superfície de filme de seda estampados durante uma hora 18. período de tempo. As células foram semeadas a 10k/cm densidade ² e cultivadas durante 2 horas. antes de imagem. Clique aqui para ver filme .

Video 2. Lapso de tempo imagens de contraste de fase de células que migram HCLE sobre uma superfície plana de controle TCP durante uma hora 18. período de tempo. As células foram semeadas a 10k/cm densidade ² e cultivadas durante 2 horas. antes de imagem. Clique aqui para ver filme .

Discussão

A utilização de películas de seda regeneradas como um substrato para a cultura de células ganhou em popularidade ao longo das duas últimas décadas, devido à extensa caracterização das propriedades do material desta proteína e aumento da compreensão da sua utilidade biomaterial ^3,8. O sistema de cultura descrito aqui representa um novo sistema de testes in vitro para avaliar as interações de superfície celular em seda estampados filme biomaterial substratos ^7. O sistema permite a análise em profundidade das interações celulares ao longo do tempo que podem ser facilmente adotados para alto rendimento de coleta de dados. Isto é largamente activado porque os filmes de seda possuir um número de propriedades sintonizáveis ​​biomaterial que pode ser modificada para afectar directamente a função da célula ^8,9,12, incluindo: controlo de superfície micro / nano-topografia de superfície ^7; químicas de superfície diferentes através da modificação covalente ou adsorção de moléculas biologicamente ativas ^13; mech robustapropriedades anical ^15,16, controle da hidrofilicidade material / hidrofobicidade ^16; carregamento em massa de compostos biológicos para a liberação ^4,8,17, e de dissolução controlada / taxas de degradação enzimática através do controle da estrutura secundária (conteúdo folha beta) ^11,18,19 .

A transparência de filmes de seda é conseguido através de recozimento dos filmes por um período de tempo sob vácuo na presença de vapor de água ^7,15. Esta abordagem permite o processamento para a formação de folhas β estrutura secundária, promovendo a insolubilidade do material em água, permitindo simultaneamente difracção mínima de luz ^15. Essa transparência de filmes é fundamental para permitir que imagens ao vivo direto de célula que pode ser contratado com um número de modalidades de imagem (ou seja, de campo amplo e fluorescência) usando qualquer número de sistemas de microscópio ^12,20. Além vivo de células de imagem, os filmes de seda pode ser facilmente removido do thsistema de cultura e para permitir a fixação adicional e análise. Assim, a grande variedade de directos avaliações experimentais que podem ser realizados neste sistema são aplicáveis ​​a uma grande variedade de células / tecido fontes para muitos campos técnicos ^{3,8,9,12,13,21.} Os resultados lapso de tempo de imagens ilustram como os dados em tempo real de cultura podem ser recolhidos, e como exemplo, foram utilizadas para ilustrar como topografia da superfície afeta as interações celulares. Os resultados representativos demonstram como biomateriais filme de seda podem ser utilizadas para suportar o crescimento da cultura HCLE, e são alteráveis ​​a um número de proliferação celular padrão e ensaios de metabólicas (Fig. 4). Além disso, as culturas são fixadas e processadas para digitalização de imagens de electrões ou outros protocolos (Fig. 3).

Substratos filme de seda são produzidas no laboratório com alta fidelidade, a consistência, e com um custo relativamente baixo (Fig. 1). Isto permite reprodutibilidadedade, tanto na configuração do sistema de cultura e os resultados experimentais. Tem sido demonstrado que a água-anneal processamento produz um material de película estável dentro da cultura de seda que tem definido taxas de degradação enquanto se aguarda a concentração de proteases em solução ^2,15,22. Como resultado, estes materiais podem ser usados ​​durante períodos de tempo prolongados para a longo prazo de cultura de células, ou permanecer implantado por meses ou anos, dependendo da localização fisiológica ^8. Além disso, trabalhos recentes demonstraram que tanto a estrutura da proteína e as propriedades do material de filmes água-recozido de seda são consistentes de lote para lote permitindo resultados da cultura reprodutíveis como mostrado através de vários métodos de ensaio mecânicas e biofísica ^15,16. Além disso, a superfície do material mostrou grande fidelidade entre lotes de película, tal como indicado por SEM, de força atómica micrscopy (AFM), e os estudos de cultura de células {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: ^7,23,24} 2011kq. Stabil materialdade e consistência é um fator importante a forma como a célula irá sentir o substrato de cultivo através das vias mecanotransdução vários, e, finalmente, produzir uma resposta desejada / não desejada celular ^25,26.

Normas históricos para substratos de cultura, tais como o plástico de cultura de tecidos tratados ou de vidro, proporcionar substratos adequados para ligação celular. No entanto, estes materiais não são alteráveis ​​para a utilidade adicional in vivo. Pode ser previsto que um filme de seda biomaterial pode ser personalizado in vitro, e uma vez expectativas experimentais foram realizados a película personalizado pode ser directamente convertido para um modelo in vivo. Desenho emparelhado tais entre in vitro e in vivo experimentação oferece uma grande vantagem para tais biomateriais de seda implantáveis ​​mais de outros substratos que são rotineiramente usados ​​in vitro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do material	Companhia	Número de Catálogo
Casulos de seda	Tajima Shoji Co., LTD.	NA
PDMS e monômero de reticulação	Momentive	RTV615A 01P
Carbonato de Sódio	Sigma	S2127
Brometo de lítio	Sigma	213225
Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66110
Seringa de 1 mL	Becton-Dickenson	309602
Arruela de aço inoxidável	Arruela Superior	81610
24-bem placa	VWR	353047