O organismo modelo C. elegans Usa fluido pseudocoelomic como um sistema circulatório passiva. Ensaio directo desse fluido não tem sido possível anteriormente. Aqui apresentamos uma nova técnica para ensaio diretamente do espaço extracelular, e usar sinais sistêmicos silenciamento durante uma resposta RNAi como uma prova de princípio exemplo.
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Artigo de método
Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de
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Resumo
Resumo
O organismo geneticamente tratável modelo C. elegans tem fornecido informações em uma miríade de questões biológicas, habilitado pelo seu tempo de geração curto, facilidade de crescimento e tamanho pequeno. Este pequeno tamanho, no entanto, não permitiu um certo número de abordagens técnicas encontradas em outros sistemas de modelos. Por exemplo, as transfusões de sangue em mamíferos e técnicas de enxertia em plantas permitem fazer perguntas de composição sistema circulatório e sinalização. O sistema circulatório do worm, o pseudoceloma, até recentemente sido impossível ensaio diretamente. Para responder as questões de sinalização intercelular e sistema circulatório composição C. elegans pesquisadores têm tradicionalmente virou-se para análise genética, a célula / tecido específico de salvamento, e análise de mosaico. Estas técnicas proporcionam um meio para se inferir o que se passa entre as células, mas não são universalmente aplicáveis na identificação e caracterização de moléculas extracelulares. Apresentamos aqui uma newly técnica desenvolvida para o fluido de ensaio directamente pseudocoelomic de C. elegans. A técnica começa com qualquer manipulação genética ou física para aumentar o volume de fluido extracelular. Depois os animais são submetidos a uma técnica de micro-injecção reversa vampiric utilizando um equipamento que permite a micro-injecção de controlo de pressão fino equilíbrio. Após o isolamento do fluido extracelular, o fluido recolhido pode ser testada por transferência para outros animais, ou por via molecular. Para demonstrar a eficácia da presente técnica é apresentada uma abordagem detalhada do ensaio de um exemplo específico de moléculas de sinalização extracelulares, dsRNA longo durante uma resposta sistémica RNAi. Apesar de caracterização de RNAi sistêmica é uma prova de princípio exemplo, vemos esta técnica como sendo adaptável para atender uma variedade de questões de composição sistema circulatório e sinalização.
Protocolo
1. Preparação dos Materiais
O material necessário para vampiric microinjecção reversa é semelhante ao que é necessário para as técnicas de microinjeção padrão usados para fazer transgénico C. elegans estirpes 1. Apesar de alguns reagentes (por exemplo, placas de ensaio) são feitas no dia da transferência experimental, muitos dos materiais devem ser preparados de forma coordenada ao longo de um período de oito dias (ver quadro 1 para a tabela de tempo). Como tal, é importante planejar com cuidado ao usar esta técnica (para os reagentes e equipamentos necessários ver Tabela 2).
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Discussão
Nós apresentamos aqui um novo método que permite o isolamento e caracterização de fluido extracelular a partir do modelo de organismo C. elegans. A técnica começa com a manipulação genética ou física de vermes dos doadores para aumentar o seu volume total de fluido extracelular. Fluido extracelular é então isolado utilizando uma técnica de micro-injecção modificada. Os sem-fins são montados por microinjecção utilizando almofadas de agarose secos para manter os vermes ainda durante o procedimento. A ligação físi.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer a natureza colaborativa do laboratório de Hunter, e agradecê-los para a discussão útil e assistência que fez do desenvolvimento desta técnica possível e divertido. Gostaríamos de agradecer a Nigel Delaney eo Caenorhabditis Genética Centro de verme e cepas bacterianas. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health GM089795 subvenção para CPH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dia Prep Worm Prep material | |||
| -7 Ou antes | Manter limpo, bem alimentado Clr-1 (e1745) E N2 vermes | Faça tapetes de injeção, placas NGM, NGM + Carb / placas de IPTG, OP50 ações LB | |
| -6 | Streak fora RNAi comida na LB + Carb | ||
| -5 | Inocular 3 ml durante a noite com RNAi alimentos | ||
| -4 | Mover embriões para RNAi placa | Semente RNAi placa | |
| -3 | |||
| -2 | |||
| -1 | |||
| 0 | Mudança vermes para 25 por 4 horas | Faça placas de ensaio | |
| Mover vermes para limpar as placas NGM | |||
| Vampiric transferência | |||
| Recuperar destinatário | |||
| 1 | Remover destinatário da transferência | ||
| 2 | Progênie Pontuação |
Quadro 1. Cronograma de preparação do material.
| Equipamentos Empresa Número de catálogo | ||
|---|---|---|
| Pressão picolitros Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming / Brown micropipeta Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagentes | ||
| Óleo Mineral | EM Science | MX1560-1 |
| 22x50 no 1 ½ tampa de vidro | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Vidro borosilicato Capilares | Mundo Precisões Instruments | 1B100F-4 |
| Solução de hipoclorito de sódio (5% de cloro disponível) | JT Baker | 9416-01 |
| C. elegans E cepas bacterianas | ||
| Clr-1 (e1745) II 9 | O Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) | CB3241 |
| GLP-1 RNAi vetor 10 | Fonte de Biociências (Ahringer Biblioteca Alimentação) | F02A9.6 |
| PAL-1 RNAi vetor 11 | PHC187 | |
| OP50-GFP 5 | O Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP |
Tabela 2. Reagentes e equipamentos específicos.
Referências
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 con....
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Isolamento de Fluido ExtracelularPseudoceloma de C. elegansMicroinjeção Reversa VampíricaEnsaio de RNAi SistêmicoTransferência de Sinalização de dsRNAControle de Pressão de MicroinjeçãoAnálise de Fluido PseudocelomicoPontuação Fenotípica de RNAiTransferência de Fluido de VermesPreparação de Placas NGM
