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Artigo de método

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

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DOI:

10.3791/3657

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8 de março de 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Parasitology, College of Basic Medical Sciences, China Medical University , 2Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences , 3Department of Pathology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

Resumo

Foi desenvolvido um protocolo para superar as dificuldades de isolamento e caracterização de linfócitos T raros específicos para patógenos, como o papilomavírus humano (HPV), que causam infecções localizadas. Os passos envolvidos incluem a identificação da(s) região(ões) das proteínas do HPV que contêm epítopo(s) de linfócito T a partir de um indivíduo, a seleção dos linfócitos T específicos pelo peptídeo com base na secreção de interferon-γ (IFN-γ) e o cultivo e caracterização dos clones de linfócitos T (Fig. 1). O indivíduo 1 era um paciente recém-diagnosticado com lesão intraepitelial escamosa de alto grau por biópsia e submetido ao procedimento cirúrgico de excisão com alça diatérmica no dia em que os linfócitos T foram coletados1. Uma região nas proteínas E6 e E7 do papilomavírus humano tipo 16 (HPV 16) que continha um epítopo de linfócito T foi identificada por meio de um ensaio de imunospot ligado à enzima para IFN-γ (ELISPOT) realizado com peptídeos sintéticos sobrepostos (Fig. 2). Os dados desse ensaio foram utilizados não apenas para identificar uma região que contém um epítopo de linfócito T, mas também para estimar o número de linfócitos T específicos para o epítopo e isolá-los com base na secreção de IFN-γ, utilizando microesferas magnéticas comercialmente disponíveis (kit de isolamento de linfócitos T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Os linfócitos T selecionados secretadores de IFN-γ foram diluídos e cultivados individualmente na presença de uma mistura de células alimentadoras irradiadas, a fim de suportar o crescimento de um único linfócito T por poço. Esses clones de linfócitos T foram triados por meio de um ensaio ELISPOT para IFN-γ na presença de peptídeos que cobrem a região identificada e células B linfoblastoides autólogas transformadas pelo vírus Epstein-Barr (LCLs, obtidas conforme descrito por Walls e Crawford)2, com o objetivo de minimizar o número de células necessárias do clone de linfócito T. Em vez de utilizar 1 x 105 células por poço, quantidade tipicamente usada em ensaios ELISPOT1,3, foram utilizadas 1.000 células do clone de linfócito T na presença de 1 x 105 LCLs autólogas, reduzindo drasticamente o número de células do clone de linfócito T necessárias. As LCLs autólogas serviram não apenas para apresentar antígenos peptídicos às células do clone de linfócito T, mas também para manter uma alta densidade celular nos poços, permitindo que as células do clone de linfócito T específicas para o epítopo secretassem IFN-γ. Isso garante o bom desempenho do ensaio ELISPOT para IFN-γ. Da mesma forma, ensaios ELISPOT para IFN-γ foram utilizados para caracterizar a sequência mínima e ótima de aminoácidos do epítopo de linfócito T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e seu elemento de restrição da classe I do HLA (B58). O ensaio ELISPOT para IFN-γ também foi realizado utilizando LCLs autólogas infectadas com vírus vaccínia que expressavam a proteína E6 ou E7 do HPV 16. O resultado demonstrou que o epítopo de linfócito T E6 foi processado endogenamente. Foi demonstrada a reconhecimento cruzado do epítopo de linfócito T homólogo de outros tipos de HPV de alto risco. Este método também pode ser usado para descrever epítopos de linfócitos T CD44.

Protocolo

Ao realizar um ensaio ELISPOT de IFN-γ com uma linhagem de células T CD8 estabelecida a partir do Sujeito 1, determinou-se que a região E6 46-70 do HPV 16 contém um epítopo de células T1 (Fig. 2), e as células T específicas para o epítopo foram selecionadas com base na secreção de IFN-γ antes do início deste protocolo (Fig. 1).

1. Diluição Limite de Linfócitos T Específicos por Epítopo

  1. Prepare a mistura de células alimentadoras combinando células mononucleares do sangue periférico alogênicas irradiadas (4.000 rad) a 5 x 105 células/ml, linhagens celulares de linfoblastos alogênicas (LCLs) irradiadas (5.000 rad) a 5 x 104 células/ml e fitohemaglutinina (PHA) a 0,1 μg/ml, utilizando meio completo de Yssel contendo 1% de soro humano em pool. As células devem ser manipuladas em condições estéreis durante todo o protocolo.
  2. Dilua em série as células T específicas pelo epítopo isoladas (Fig. 3) usando a mistura de células alimentadoras até que a concentração atinja 0,5 célula/100 μl ou 5 células/1 ml. Utilize aproximadamente 3 x 103 células T específicas pelo epítopo.
  3. Plaque 100 μl por poço das células T específicas pelo epítopo diluídas em um total de 30 a 60 placas de 96 poços com fundo redondo, utilizando uma pipeta multicanal.
  4. Incube as placas em estufa a 37 °C, 5% CO2.
  5. No Dia 5, adicione 100 μl de meio completo de Yssel contendo 20 u/ml de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2).
  6. Identifique visualmente os clones de células T em crescimento nas placas de 96 poços com fundo redondo pelo tamanho acentuado dos seus pellets no fundo.
  7. Entre o Dia 11 e 14, prepare uma nova mistura de células alimentadoras combinando células mononucleares do sangue periférico alogênicas irradiadas (4.000 rad) a 1 x 106 células/ml, linhagens celulares de linfoblastos alogênicas (LCLs) irradiadas (5.000 rad) a 1 x 105 células/ml e PHA a 0,1 μg/ml, utilizando meio completo de Yssel. Plaque essa nova mistura de células alimentadoras em uma placa de 24 poços, com 1 ml por poço.
  8. Aspire individualmente os clones de células T de cada poço utilizando uma micropipeta com capacidade de aproximadamente 200 μl.
  9. Transfira individualmente os clones de células T para a placa de 24 poços contendo a nova mistura de células alimentadoras. Repita até que todos os clones de células T tenham sido transferidos.

2. Identificação de Clones de Linfócitos T Específicos de Epítopos Utilizando um Ensaio ELISPOT de Triagem em Alta Escala (Adaptado de um método descrito por Larsson et al.5)

  1. Cubra 2 placas estéreis de ELISPOT (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) com 50 μl por poço de anticorpo monoclonal primário anti-IFN-γ (clone D1K, Mabtech, Stockholm, Suécia) diluído a 5 μg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril de grau para cultura de tecidos por um mínimo de 1 hora a 4 °C.
  2. Lave os poços com 150 a 200 μl por poço de PBS, adicionando e descartando. Repita mais três vezes.
  3. Bloqueie a ligação não específica adicionando 50 μl por poço de soro humano pool diluído a 5% em RPMI 1640 por pelo menos 1 hora a 37 °C, 5% CO2. Remova bolhas grandes perfurando-as com uma agulha estéril.
  4. Adicione 1 x 105 LCLs autólogas2 em 50 μl de RPMI 1640 com 5% de soro humano por poço.
  5. Agite as células em cada poço da placa de 24 poços contendo os clones de linfócitos T com uma pipeta de 1 ml. Transfira 100 μl por poço para um tubo Eppendorf estéril. Adicione 500 μl de RPMI 1640 com 5% de soro humano pool a cada tubo Eppendorf e centrifugue em microcentrífuga a 3.000 RPM por 5 minutos.
  6. Descarte o sobrenadante dos tubos Eppendorf, adicione 110 μl de RPMI 1640 com 5% de soro humano por tubo e ressuspenda as células usando um vórtex.
  7. Adicione 50 μl de meio contendo um clone específico de linfócitos T, independentemente do número de células, para triagem rápida, em poços correspondentes nas duas placas. Repita para todos os clones de linfócitos T. Ao eliminar as etapas de contagem celular, um grande número de clones de linfócitos T pode ser testado simultaneamente.
  8. Combine o meio restante de vários tubos Eppendorf e adicione 50 μl para os próximos poços correspondentes que serão usados como poços de controle positivo aos quais será adicionado PHA.
  9. Adicione 50 μl de RPMI 1640 com 5% de soro humano pool a cada poço que servirá como controle negativo, sem adição de clones de linfócitos T.
  10. Adicione os peptídeos contidos na região positiva (Tabela 1) em 50 μl por poço, para uma concentração final de 10 μM por peptídeo. Os estoques de peptídeos são dissolvidos a 5 mM cada em 5% a 15% de dimetilsulfóxido em PBS, dependendo da solubilidade do peptídeo. Cada poço conterá um volume final de 200 μl (50 μl de bloqueio, 50 μl de LCLs, 50 μl de clones de linfócitos T e 50 μl de peptídeos).
  11. Adicione 50 μl de PHA (concentração final de 10 μg/ml) aos poços de controle positivo.
  12. Adicione 50 μl de RPMI 1640 com 5% de soro humano pool aos poços de controle negativo.
  13. Incube durante a noite a 37 °C, 5% CO2.
  14. Lave os poços com 150 a 200 μl por poço de PBS com 0,05% de Tween-20, adicionando e descartando. Repita mais três vezes.
  15. Adicione 50 μl de PBS contendo 1 μg/ml de anticorpo monoclonal anti-IFN-γ conjugado com biotina (clone 7B-6, Mabtech) e incube a 37 °C, 5% CO2 por 2 horas. Remova bolhas grandes perfurando-as com uma agulha.
  16. Vinte minutos antes do término da incubação de 2 horas, prepare a peroxidase do rabo-de-cavalo biotinilada ligada à avidina (kit Vectastain Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) adicionando 2 gotas de solução A e 2 gotas de solução B a 5 ml de PBS contendo 0,1% de Tween-20.
  17. Lave os poços com 150 a 200 μl por poço de PBS com 0,1% de Tween-20, adicionando e descartando. Repita mais três vezes.
  18. Adicione 50 μl por poço da peroxidase do rabo-de-cavalo biotinilada e incube a 37 °C, 5% CO2 por 1 hora. Remova bolhas grandes perfurando-as com uma agulha.
  19. Lave os poços com 150 a 200 μl por poço de PBS com 0,1% de Tween-20, adicionando e descartando. Repita mais três vezes.
  20. Adicione 50 μl por poço de um reagente cromogênico chamado diaminobenzidina estável (DAB) à temperatura ambiente por 5 minutos. Remova bolhas grandes perfurando-as com uma agulha.
  21. Lave os poços com 150 a 200 μl por poço de água desionizada, adicionando e descartando. Repita mais duas vezes.
  22. Deixe a placa secar completamente.
  23. Conte as manchas usando um microscópio estereoscópico ou um leitor automatizado de ELISPOT (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Alemanha).

3. Confirmando a Natureza Epitopo-específica dos Clones de Linfócitos T Utilizando o Ensaio ELISPOT (Fig. 4)

  1. Selecione clones de linfócitos T com bom crescimento. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 105 LCLs autólogas e 1 x 103 células do clone de linfócitos T por poço serão semeadas juntamente com um de cada um dos três peptídeos contidos na região (Tabela 1) a 10 μM. Monte o ensaio em duplicata ou triplicata.

4. Determinação de se o Epítopo é Processado Endogenamente (Fig. 5)

  1. Selecione clones de linfócitos T com bom crescimento. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 105 LCLs autólogas infectadas com vírus vaccinia recombinante expressando E6 e E7 do HPV 16 6 (antes do ensaio) ou nenhuma (tipo selvagem, linhagem WR) (multiplicidade de infecção de 5 por 1 hora) e 1 x 103 células do clone de linfócitos T por poço serão semeadas.

5. Caracterização da Sequência Mínima e Ótima do Epítopo de Célula T (Figuras 6a, 6b e 6c)

  1. Selecione clones de células T com bom crescimento. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 105 LCLs autólogas e 1 x 103 células do clone de células T por poço serão semeadas juntamente com um dos peptídeos sobrepostos de 9 resíduos que cobrem a região (Tabela 1) na concentração de 10 μM (Fig. 6a).
  2. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 105 LCLs autólogas e 1 x 103 células do clone de células T por poço serão semeadas juntamente com um dos peptídeos da série de comprimentos variáveis (Tabela 1) na concentração de 10 μM (Fig. 6b).
  3. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 105 LCLs autólogas e 1 x 103 células do clone de células T por poço serão semeadas juntamente com alguns poucos peptídeos com maior probabilidade de conter a sequência mínima e ótima de aminoácidos. Esses peptídeos serão testados em concentrações que variam de 10-5 M a 10-10 M (Fig. 6c).

6. Identificação do Elemento de Restrição Utilizando o Ensaio ELISPOT (Fig. 7)

  1. Selecione clones de linfócitos T com bom crescimento. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 103 células do clone de linfócitos T por poço serão semeadas junto com o peptídeo mínimo e o peptídeo ótimo a 10 μM. Também serão semeadas cem mil LCLs alogênicos por poço, compartilhando uma ou duas moléculas de HLA classe I com o indivíduo em estudo.

7. Estudo da reatividade cruzada de clones de células T específicos por epítopos frente a sequências de aminoácidos homólogas de outros tipos de HPV de alto risco (Fig. 8)

  1. Selecione clones de células T com bom crescimento. Realize um ensaio de ELISPOT conforme descrito anteriormente, exceto que 1 x 103 células do clone de células T por poço serão semeadas juntamente com peptídeos (10 μM) contendo sequências de aminoácidos homólogas de outros tipos de HPV de alto risco (Tabela 2). Cem mil LCLs autólogas por poço e LCLs alogênicas expressando as moléculas de classe I HLA restritivas também serão semeadas em poços separados.

8. Resultados Representativos

O sujeito 1 apresentado aqui foi uma mulher afro-americana de 22 anos com histórico recente de lesão intraepitelial escamosa de alto grau diagnosticada por biópsia. Ela compareceu para tratamento com procedimento de excisão por alça elétrica no dia em que os linfócitos T foram coletados1. O ensaio ELISPOT da linhagem de linfócitos T CD8 mostrou que a região HPV 16 E6 46-70 (cada região é testada com 3 peptídeos sobrepostos de 15 aminoácidos) continha um epítopo de linfócitos T (Fig. 2). O número de linfócitos T específicos para o epítopo selecionados com base na secreção de IFN-γ foi de 1,2 x 105. Após realizar diluição limitante (Fig. 3) em um quinto das células selecionadas, foram obtidos 262 clones de linfócitos T. As células selecionadas restantes não foram utilizadas, pois a primeira tentativa de clonagem de linfócitos T foi bem-sucedida. O ensaio ELISPOT de triagem em alta escala realizado em 94 desses clones identificou 62 clones positivos na triagem, que podem ser facilmente identificados macroscopicamente na placa ELISPOT. Os demais clones de linfócitos T não foram testados, pois o primeiro ensaio ELISPOT identificou clones de linfócitos T específicos para o peptídeo. Oito clones positivos na triagem com bom crescimento foram retestados individualmente com os três peptídeos de 15 aminoácidos que cobrem a região (Fig. 4). Todos os clones de linfócitos T foram positivos com os peptídeos HPV 16 E6 51-65, 6 dos 8 clones foram positivos com o peptídeo E6 46-60 e nenhum dos clones foi positivo com o peptídeo E6 56-70. O teste com LCLs autólogas infectadas com um vírus vaccínia recombinante que expressa a proteína HPV 16 E6 ou E7 demonstrou que os clones de linfócitos T reconhecem um epítopo E6 processado endogenamente (Fig. 5). O teste com uma série de peptídeos sobrepostos de 9 aminoácidos que cobrem a região HPV 16 46-65 (Tabela 1) demonstrou a melhor resposta com o peptídeo E6 53-61 (Fig. 6a). Os dois peptídeos de 10 aminoácidos que contêm o peptídeo E6 53-61, dois peptídeos de 8 aminoácidos contidos no peptídeo E6 53-61 e um peptídeo de 11 aminoácidos que contém os dois peptídeos de 10 aminoácidos foram testados, e o peptídeo E6 52-61 (10-mer) foi a sequência mínima e ótima mais consistente (Fig. 6b). No entanto, o peptídeo E6 53-61 (9-mer) apresentou resposta igualmente forte com o clone de linfócitos T #79. Esse clone de linfócitos T foi testado com esses dois peptídeos em uma faixa mais ampla de concentrações, e o peptídeo E6 52-61 (10-mer) manteve a positividade de forma muito mais eficaz do que o peptídeo E6 53-61 (9-mer) em concentrações mais baixas de peptídeo (Fig. 6c). O peptídeo mais longo E6 52-62 (11-mer) não foi testado, pois o objetivo era definir a sequência mais curta que demonstra uma resposta robusta. Concluiu-se que o peptídeo E6 52-61 (10-mer) contém a sequência mínima e ótima.

A molécula HLA classe I restritiva do epítopo de células T CD8 pode ser examinada utilizando um ensaio ELISPOT que emprega LCLs alogênicos que expressam uma ou duas moléculas HLA classe I comuns ao indivíduo. No entanto, os resultados foram inconclusivos para o Indivíduo 1 devido a um fundo elevado observado no ensaio ELISPOT. A molécula HLA classe I restritiva para o Indivíduo 1 foi posteriormente identificada como sendo B58, utilizando um ensaio de liberação de cromo (dados não mostrados). Fig. 7 mostra um exemplo de outro indivíduo [Indivíduo A, que foi encontrado para detectar a sequência mínima e ótima de E6 75-83 (KFYSKISEY), conforme descrito por Wang et al.]7. Alta positividade é observada com uma LCL que expressa as moléculas B62 e Cw3, enquanto positividade de fundo é observada com uma LCL que expressa Cw3. Um ensaio de liberação de cromo confirmou que a molécula B62 foi o elemento restritivo para o Indivíduo A7.

Algumas regiões do genoma do HPV são bem conservadas, e sequências homólogas às regiões E6 52-61 do HPV 16 estavam presentes em outros 13 tipos de HPV de alto risco (Tabela 2). Foi demonstrado forte reconhecimento cruzado (>50% das unidades formadoras de colônias para o peptídeo E6 52-61 do HPV 16) para 8 dos 13 tipos de HPV de alto risco (Fig. 8).

Fluxograma da identificação de epítopos de células T usando ensaio ELISPOT; os processos incluem isolamento e análise.
Figura 1. Esquema geral que descreve a série de experimentos para a caracterização de epítopo(s) novos de células T. Este artigo descreve o protocolo a partir da terceira caixa contada a partir do topo.

Gráfico de barras da resposta imune, unidades formadoras de colônias versus regiões de peptídeos, pico dominante em E6 observado.
Figura 2. Um ensaio ELISPOT realizado para identificar região(ões) contendo o epítopo de células T. Cem mil células T CD8 estimuladas in vitro por poço foram semeadas juntamente com três peptídeos sobrepostos de 15 resíduos (10 μM cada), cobrindo cada região das proteínas E6 e E7 do HPV 16. Este exemplo do Sujeito 1 mostrou a presença de um epítopo de células T na região E6 46-70. As barras representam os erros padrão das médias.

Diagrama do processo de diluição para cultura celular, diluição passo a passo para obter 0,5 célula por poço.
Figura 3. Esquema mostrando como diluir células T específicas para epítopos usando uma mistura de células alimentadoras até uma concentração de 0,5 célula por poço.

Gráfico de barras de unidades formadoras de colônias por clone; comparando os peptídeos PHA, E6 46-60, E6 51-65, E6 56-70.
Figura 4. Um ensaio ELISPOT realizado para identificar sub-regiões contendo o epítopo de células T, testando individualmente os três peptídeos de 15 resíduos. Este exemplo do Sujeito 1 mostrou a presença do epítopo nas sub-regiões E6 46-60 e E6 51-65. As barras representam os erros padrão das médias.

Gráfico de barras, unidades formadoras de manchas por poço; clones #5-79; ensaios PHA, E6-Vac, E7-Vac, WR; resposta imune.
Figura 5. Um ensaio ELISPOT realizado para examinar se o epítopo de células T é apresentado endogenamente. Este exemplo do Sujeito 1 revelou que os clones de células T reconheceram um epítopo E6 processado endogenamente. As barras representam os erros padrão das médias.

Gráfico de unidades formadoras de colônias analisando a resposta a peptídeos; inclui gráficos de barras e de linhas com dados de clones.

Figura 6. Ensaios ELISPOT realizados para caracterizar a sequência peptídica mais curta e ótima do epítopo de células T. Os mesmos clones foram utilizados ao longo do estudo, sempre que disponíveis. (a) Um ensaio ELISPOT realizado utilizando peptídeos sobrepostos de 9 resíduos. Este exemplo do Sujeito 1 revelou que o epítopo está localizado na sub-região E6 53-61. (b) Um ensaio ELISPOT realizado para identificar a sequência peptídica mínima e ótima, utilizando peptídeos de diferentes comprimentos. Este exemplo revelou que a sequência peptídica mais curta e ótima foi, de forma mais consistente, o peptídeo E6 52-61, seguido pelo peptídeo E6 53-61. (c) Um ensaio ELISPOT realizado para confirmar qual peptídeo contém a sequência mínima e ótima. O peptídeo E6 52-61 manteve positividade em concentrações mais baixas e foi determinado como sendo a sequência mais curta e ótima. As barras representam os erros padrão da média.

Gráfico de barras de unidades formadoras de colônias de linfócitos por clone, comparando LCLs autólogos e alogênicos compatíveis.


Figura 7. Um ensaio ELISPOT realizado para identificar a molécula de classe I HLA restritiva. Este exemplo apoiou a ideia de que a molécula B62 é o elemento restritivo para o clone de linfócitos T CD8 do Sujeito A que reconhece o epítopo HPV 16 E6 75-837. Isso foi confirmado por um ensaio de liberação de cromo. As barras representam os erros padrão das médias.

Gráfico de barras da resposta imune ao HPV; unidades formadoras de colônias por poço; comparação entre LCL autólogo/alogênico.
Figura 8. Um ensaio de ELISPOT realizado para avaliar a reatividade cruzada dos clones de linfócitos T específicos para a sequência 52-61 do HPV 16 frente a sequências semelhantes de outros tipos de HPV de alto risco (Tabela 2). Este exemplo do Sujeito 1 demonstrou reatividade cruzada significativa (>50% de positividade em comparação com o HPV 16 52-61) em 8 dos 13 outros tipos de HPV de alto risco analisados. As barras representam os erros padrão das médias.

Tipo de VPHResíduos de AA*Sequência^
16E6 46-60 (15)RREVYDFAFRDLCIV
16E6 51-65 (15)DFAFRDLCIVYRDGN
16E6 56-70 (15)DLCIVYRDGNPYAVC
16E6 52-62 (11)FAFRDLCIVYR
16E6 52-61 (10)FAFRDLCIVY
16E6 53-62 (10)AFRDLCIVYR
16E6 46-54 (9)RREVYDFAF
16E6 47-55 (9)REVYDFAFR
16E6 48-56 (9)EVYDFAFRD
16E6 49-57 (9)VYDFAFRDL
16E6 50-58 (9)YDFAFRDLC
16E6 51-59 (9)DFAFRDLCI
16E6 52-60 (9)FAFRDLCIV
16E6 53-61 (9)AFRDLCIVY
16E6 54-62 (9)FRDLCIVYR
16E6 55-63 (9)RDLCIVYRD
16E6 56-64 (9)DLCIVYRDG
16E6 57-65 (9)LCIVYRDGN
16E6 53-60 (8)AFRDLCIV
16E6 54-61 (8)FRDLCIVY

* O número de aminoácidos é indicado entre parênteses.

Tabela 1. Sequências de aminoácidos dos peptídeos E6 do HPV 16 utilizados para definir a sequência peptídica antigênica mínima e ótima.

Tipo de VPHResíduos de AA*Sequência^
16E6 52-61(10)FAFRDLCIVY
18E6 47-56 (10)FAFKDLFVVY
31E6 45-54 (10)FAFTDLTIVY
33E6 45-54 (10)FAFADLTVVY
35E6 45-54 (10)FACYDLCIVY
39E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
45E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
51E6 45-54 (10)VAFTEIKIVY
52E6 45-54 (10)FLFTDLRIVY
56E6 48-57 (10)FACTELKLVY
58E6 45-54 (10)FVFADLRIVY
59E6 47-56 (10)FAFNDLFIVY
68E6 47-56 (10)FAFGDLNVVY
73E6 45-54 (10)FAFSDLCIVY

* O número de aminoácidos é indicado entre parênteses.
^ Resíduos de aminoácidos diferentes dos presentes no epítopo E6 do HPV-16 52-61 são indicados em negrito.

Tabela 2. Sequências de aminoácidos de peptídeos de tipos de HPV de alto risco homólogos aos epítopos de células T CD8 E6 52-61 do HPV 16, testados para avaliar o reconhecimento cruzado.

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Discussão

Tradicionalmente, os imunologistas tentavam caracterizar epítopos T celulares novos estimulando as células T de interesse in vitro e realizando um experimento de diluição limitante para isolar os clones de células T específicos pelo epítopo. Em seguida, os clones de células T eram caracterizados utilizando um ensaio de liberação de cromo 8,9. No entanto, muitas tentativas foram infrutíferas porque as frequências das células T poderiam ter sido muito baixas para serem isoladas ou porque não havia célul...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por um American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) e por subsídios do NIH (R01 CA143130 e UL1RR029884).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de isolamento de células T CD8Miltenyi Biotec130-094-156
Fito-hemaglutininaRemel, Thermo Fisher ScientificR-308528012 mg/frasco
Meio de Yssel’sGemini Bio Products400-1021% de soro humano pool
Placa de fundo redondo de 96 poçosBD Biosciences08-772-17
IL-2 recombinante humanaR&D Systems202-IL-05050μg
Placa de 24 poçosCorning07-200-84
Solução salina tamponada com fosfatoCellgroMT-21-031-CV
Anticorpo monoclonal primário anti-IFN-γ (D1K)Mabtech3420-3-1000
Anticorpo monoclonal anti-IFN-γ conjugado com biotina (7B-6)Mabtech3420-6-1000
Placa Multiscreen HA ELISPOTEMD MilliporeMAHA S45 10
Dissulfóxido de dimetiloSigma-AldrichD2650Frasco de 100 ml
Soro humano poolAtlanta BiologicalsS40510HInativar pelo calor
RPMI 1640CellgroMT-10-040-CV
Tween-20Sigma-AldrichP2287-100ml
Kit Vectastain Elite ABCVector LaboratoriesNC9313719
Diaminobenzidina estávelOpen BiosystemsMBI 1241
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Referências

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Ensaio ELISPOT de Interferon GamaCaracteriza o de Ep topos de C lulas TProte nas E6 E7 do HPV 16Isolamento de C lulas T Espec ficas para Ant genosDetec o de Secre o de IFN gamaApresenta o por LCLs Aut logasClonagem de C lulas T Espec ficas para Ep toposRestri o de HLA Classe IReatividade Cruzada de Tipos de HPVSequ ncia Pept dica M nima Otimizada
O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano
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