O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

Resumo

A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

Resumo

Foi desenvolvido um protocolo para superar as dificuldades de isolamento e caracterização de linfócitos T raros específicos para patógenos, como o papilomavírus humano (HPV), que causam infecções localizadas. Os passos envolvidos incluem a identificação da(s) região(ões) das proteínas do HPV que contêm epítopo(s) de linfócito T a partir de um indivíduo, a seleção dos linfócitos T específicos pelo peptídeo com base na secreção de interferon-γ (IFN-γ) e o cultivo e caracterização dos clones de linfócitos T (Fig. 1). O indivíduo 1 era um paciente recém-diagnosticado com lesão intraepitelial escamosa de alto grau por biópsia e submetido ao procedimento cirúrgico de excisão com alça diatérmica no dia em que os linfócitos T foram coletados¹. Uma região nas proteínas E6 e E7 do papilomavírus humano tipo 16 (HPV 16) que continha um epítopo de linfócito T foi identificada por meio de um ensaio de imunospot ligado à enzima para IFN-γ (ELISPOT) realizado com peptídeos sintéticos sobrepostos (Fig. 2). Os dados desse ensaio foram utilizados não apenas para identificar uma região que contém um epítopo de linfócito T, mas também para estimar o número de linfócitos T específicos para o epítopo e isolá-los com base na secreção de IFN-γ, utilizando microesferas magnéticas comercialmente disponíveis (kit de isolamento de linfócitos T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Os linfócitos T selecionados secretadores de IFN-γ foram diluídos e cultivados individualmente na presença de uma mistura de células alimentadoras irradiadas, a fim de suportar o crescimento de um único linfócito T por poço. Esses clones de linfócitos T foram triados por meio de um ensaio ELISPOT para IFN-γ na presença de peptídeos que cobrem a região identificada e células B linfoblastoides autólogas transformadas pelo vírus Epstein-Barr (LCLs, obtidas conforme descrito por Walls e Crawford)², com o objetivo de minimizar o número de células necessárias do clone de linfócito T. Em vez de utilizar 1 x 10⁵ células por poço, quantidade tipicamente usada em ensaios ELISPOT^1,3, foram utilizadas 1.000 células do clone de linfócito T na presença de 1 x 10⁵ LCLs autólogas, reduzindo drasticamente o número de células do clone de linfócito T necessárias. As LCLs autólogas serviram não apenas para apresentar antígenos peptídicos às células do clone de linfócito T, mas também para manter uma alta densidade celular nos poços, permitindo que as células do clone de linfócito T específicas para o epítopo secretassem IFN-γ. Isso garante o bom desempenho do ensaio ELISPOT para IFN-γ. Da mesma forma, ensaios ELISPOT para IFN-γ foram utilizados para caracterizar a sequência mínima e ótima de aminoácidos do epítopo de linfócito T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e seu elemento de restrição da classe I do HLA (B58). O ensaio ELISPOT para IFN-γ também foi realizado utilizando LCLs autólogas infectadas com vírus vaccínia que expressavam a proteína E6 ou E7 do HPV 16. O resultado demonstrou que o epítopo de linfócito T E6 foi processado endogenamente. Foi demonstrada a reconhecimento cruzado do epítopo de linfócito T homólogo de outros tipos de HPV de alto risco. Este método também pode ser usado para descrever epítopos de linfócitos T CD4⁴.

Protocolo

Ao realizar um ensaio ELISPOT de IFN-γ com uma linhagem de células T CD8 estabelecida a partir do Sujeito 1, determinou-se que a região E6 46-70 do HPV 16 contém um epítopo de células T¹ (Fig. 2), e as células T específicas para o epítopo foram selecionadas com base na secreção de IFN-γ antes do início deste protocolo (Fig. 1).

1. Diluição Limite de Linfócitos T Específicos por Epítopo

1. Prepare a mistura de células alimentadoras combinando células mononucleares do sangue periférico alogênicas irradiadas (4.000 rad) a 5 x 10⁵ células/ml, linhagens celulares de linfoblastos al....

Discussão

Tradicionalmente, os imunologistas tentavam caracterizar epítopos T celulares novos estimulando as células T de interesse in vitro e realizando um experimento de diluição limitante para isolar os clones de células T específicos pelo epítopo. Em seguida, os clones de células T eram caracterizados utilizando um ensaio de liberação de cromo ^8,9. No entanto, muitas tentativas foram infrutíferas porque as frequências das células T poderiam ter sido muito baixas para serem isoladas ou porque não havia célul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de isolamento de células T CD8	Miltenyi Biotec	130-094-156
Fito-hemaglutinina	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2 mg/frasco
Meio de Yssel’s	Gemini Bio Products	400-102	1% de soro humano pool
Placa de fundo redondo de 96 poços	BD Biosciences	08-772-17
IL-2 recombinante humana	R&D Systems	202-IL-050	50μg
Placa de 24 poços	Corning	07-200-84
Solução salina tamponada com fosfato	Cellgro	MT-21-031-CV
Anticorpo monoclonal primário anti-IFN-γ (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
Anticorpo monoclonal anti-IFN-γ conjugado com biotina (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Placa Multiscreen HA ELISPOT	EMD Millipore	MAHA S45 10
Dissulfóxido de dimetilo	Sigma-Aldrich	D2650	Frasco de 100 ml
Soro humano pool	Atlanta Biologicals	S40510H	Inativar pelo calor
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Kit Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	NC9313719
Diaminobenzidina estável	Open Biosystems	MBI 1241
Leitor AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06