As projeções estereotipadas de aferentes sensoriais para a medula espinhal de roedores oferecem um sistema de fácil acesso experimental para o estudo de ramificação axonal através do rastreamento de axônios individuais.
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Artigo de método
DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos aqui uma técnica para identificar as trajetórias de pequenos grupos de neurônios DRG para a medula espinhal de embriões através da coloração difusivo usando o traçador lipofílico 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . A comparação das vias axonal de tipo selvagem com os de linhas de rato em que os genes são mutados permite testes para um papel funcional de proteínas candidato no controle de ramificação axonal que é um mecanismo essencial na fiação do sistema nervoso. Ramificação axonal permite que um neurônio individual para se conectar com múltiplos alvos, fornecendo assim a base física para o processamento paralelo de informações. Ramificações em regiões objectivo intermédio de crescimento axonal pode ser diferenciado de arborização terminal. Além disso, diferentes modos de formação ramo axonal pode ser classificada dependendo de resultados de ramificação das atividades do cone de crescimento (divisão ou bra adiadanching) ou a partir do brotamento de colaterais a partir do eixo do axônio em um processo chamado de ramificação intersticial 2 (Fig. 1).
As projeções centrais de neurônios da DRG oferecer um sistema útil experimental para estudar os dois tipos de ramificação axonal: quando seus axônios aferentes alcançar a zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) da medula espinhal entre os dias embrionários 10-13 (E10 - E13) que exibir um padrão estereotipado de T ou em forma de Y bifurcação. Os dois axônios filha resultando então prosseguir em direções rostral ou caudal, respectivamente, na margem dorsolateral da medula e só após um período de espera colaterais brotam esses axônios-tronco para penetrar na massa cinzenta (intersticial ramificação) e do projeto para os neurônios de revezamento em específico lâminas da medula espinhal, onde eles ainda arborize (terminal de ramificação) 3. Traçados DII revelaram cones de crescimento na zona da raiz dorsal entrada da medula espinhal que pareciam estar no processo de dividir o que sugere que bifurcação é causada pela divisão do cone de crescimento em si 4 (Fig. 2), no entanto, outras opções foram discutidas e 5.
Este vídeo demonstra como primeiro dissecar a medula espinhal de ratos E12.5 deixando o DRG em anexo. Fixação dos montantes seguintes diminuto exemplar da DII são aplicadas a DRG usando agulhas de vidro retirado tubos capilares. Após uma etapa de incubação, o cordão espinhal é rotulada montado como uma preparação de livro aberto invertido para analisar axônios individuais usando microscopia de fluorescência.
Protocolo
1. Procedimento de dissecção
Nota: O uso experimental de camundongos devem seguir as orientações aprovadas oficialmente para o cuidado e uso de animais de laboratório.
- Antes da preparação, configure seu microscópio de dissecação e lay out dos instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção incluindo tesouras grandes e pequenas, grandes pinças dentadas, pinças curvas e quatro conjuntos de Dumont No.5 dissecar fórceps (dois dos quais no interior polido sugestões) ( para mais detalhes veja a tabela de reagentes e equipamentos específicos). Coloque uma folha de papel de filtro em uma de 100 mm placa de Petri Sylgard r....
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Discussão
Padrões estereotipados de projeção composto por dois tipos de formação ramo axonal juntamente com facilidade de preparação em combinação com o uso de tecido fixo para DII rotulagem faz o cabo embrionárias espinhal com DRG anexado um modelo favorável ao estudo axonal ramificação. A aplicação de pequenas quantidades de DII usando agulhas de vidro revestido permite - em contraste com a rotulagem grosso do DRG - a visualização de pequenos grupos de neurônios DRG e, assim, a análise de axônios individuais e seus padrões de r.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) para comentários úteis. Este trabalho foi financiado pelo centro de pesquisa colaborativa (SFB665) do Conselho de Pesquisa Alemã (DFG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comments (opcional) |
| Estereomicroscópio Stemi RDC | Zeiss | ||
| Solução tampão fosfato (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldeído | Merck | 8.18715.1000 | |
| Tesoura cirúrgica padrão | Multa Ferramentas Ciência | 14001-13 | |
| Dentada forceps padrão | Multa Ferramentas Ciência | 11021-14 | |
| Extra fino tesoura de íris | Multa Ferramentas Ciência | 14088-10 | |
| Fórceps curvos | Multa Ferramentas Ciência | 11003-13 | |
| Dumont No.5 multa forceps dicas | Multa Ferramentas Ciência | 11254-20 | |
| Dumont No.5 acabamento espelhado forceps | Multa Ferramentas Ciência | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen Primavera tesoura | Multa Ferramentas Ciência | 15008-08 | |
| Papel-filtro | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | Precisão Instrumentos mundo | SYLG184 | |
| 100-mm placas de Petri | Greiner | 663102 | |
| 12 ml de tubos de polipropileno | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12 placa de cultura bem | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Etanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming / Brown micropipeta extrator P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Vidro borosilicato capilares | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DII (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscópio slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Tampa de vidro desliza | Carl Roth GmbH | 1870,2 |
Referências
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Ne....
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Reimpressões e permissões
