As projeções estereotipadas de aferentes sensoriais para a medula espinhal de roedores oferecem um sistema de fácil acesso experimental para o estudo de ramificação axonal através do rastreamento de axônios individuais.
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Artigo de método
DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos aqui uma técnica para identificar as trajetórias de pequenos grupos de neurônios DRG para a medula espinhal de embriões através da coloração difusivo usando o traçador lipofílico 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . A comparação das vias axonal de tipo selvagem com os de linhas de rato em que os genes são mutados permite testes para um papel funcional de proteínas candidato no controle de ramificação axonal que é um mecanismo essencial na fiação do sistema nervoso. Ramificação axonal permite que um neurônio individual para se conectar com múltiplos alvos, fornecendo assim a base física para o processamento paralelo de informações. Ramificações em regiões objectivo intermédio de crescimento axonal pode ser diferenciado de arborização terminal. Além disso, diferentes modos de formação ramo axonal pode ser classificada dependendo de resultados de ramificação das atividades do cone de crescimento (divisão ou bra adiadanching) ou a partir do brotamento de colaterais a partir do eixo do axônio em um processo chamado de ramificação intersticial 2 (Fig. 1).
As projeções centrais de neurônios da DRG oferecer um sistema útil experimental para estudar os dois tipos de ramificação axonal: quando seus axônios aferentes alcançar a zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) da medula espinhal entre os dias embrionários 10-13 (E10 - E13) que exibir um padrão estereotipado de T ou em forma de Y bifurcação. Os dois axônios filha resultando então prosseguir em direções rostral ou caudal, respectivamente, na margem dorsolateral da medula e só após um período de espera colaterais brotam esses axônios-tronco para penetrar na massa cinzenta (intersticial ramificação) e do projeto para os neurônios de revezamento em específico lâminas da medula espinhal, onde eles ainda arborize (terminal de ramificação) 3. Traçados DII revelaram cones de crescimento na zona da raiz dorsal entrada da medula espinhal que pareciam estar no processo de dividir o que sugere que bifurcação é causada pela divisão do cone de crescimento em si 4 (Fig. 2), no entanto, outras opções foram discutidas e 5.
Este vídeo demonstra como primeiro dissecar a medula espinhal de ratos E12.5 deixando o DRG em anexo. Fixação dos montantes seguintes diminuto exemplar da DII são aplicadas a DRG usando agulhas de vidro retirado tubos capilares. Após uma etapa de incubação, o cordão espinhal é rotulada montado como uma preparação de livro aberto invertido para analisar axônios individuais usando microscopia de fluorescência.
Protocolo
1. Procedimento de dissecção
Nota: O uso experimental de camundongos devem seguir as orientações aprovadas oficialmente para o cuidado e uso de animais de laboratório.
- Antes da preparação, configure seu microscópio de dissecação e lay out dos instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção incluindo tesouras grandes e pequenas, grandes pinças dentadas, pinças curvas e quatro conjuntos de Dumont No.5 dissecar fórceps (dois dos quais no interior polido sugestões) ( para mais detalhes veja a tabela de reagentes e equipamentos específicos). Coloque uma folha de papel de filtro em uma de 100 mm placa de Petri Sylgard revestido. Despeje frio PBS nos poços de uma placa de 12 poços, um de 100 mm placa de Petri e um tubo de 12 ml e deixar no gelo. Pipetar 2 ml de tampão de fixação (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,4) em cada poço de uma placa de 12 segundo poço e colocar no gelo.
- Depois de anestesiados, o sacrifício da barragem cronometrado grávida no E12.5 (detecção de plug vaginal foi designado como E0.5), coloque o mousecom o seu lado ventral para cima em três folhas de papel toalha e deixe a área abdominal com etanol 70%.
- Abra a cavidade abdominopélvica, isolar os chifres bilateral uterina e transferi-los para um dos pratos de 100 mm com gelado PBS.
- Sob controle microscópico, faça uma incisão longitudinal da parede uterina com pequenos, tesoura reta e cortar cada saco amniótico da placenta.
- Descascar o saco amniótico de cada embrião e cortar o cordão umbilical.
- Com uma tesoura pequena, decapitar os embriões e colocar a cabeça ou uma parte deles de lado para o isolamento de DNA genômico se genotipagem deve ser exigido. Posteriormente, transferir o torsi aos poços respectivos da placa de 12 bem com o frio PBS.
- Molhar o papel de filtro no prato Sylgard com algumas gotas de PBS e posição de um tronco embrionárias com o lado dorsal até no papel. Para melhor estabilidade, acertar a sua cauda e extremidades do corpo.
- Trabalharsob um microscópio de dissecação com uma ampliação de cerca de 16x, com cuidado prenda a pele do embrião acima da medula espinhal com dois pares de pinças com ponta fina e delicadamente desagregá-la. Começando no meio, vá primeiro para a cauda e, em seguida, retomar a partir do meio para o lado anterior.
- Molhado o embrião de vez em quando com duas ou três gotas de PBS para impedir que a secagem.
- Para evitar que DRG são teared fora da medula espinhal quando ela é removida do embrião destacar o DRG e da medula espinhal em torno da coluna vertebral cartilaginosa por movimentos deslizantes horizontal com a lâmina de uma pinça bem com interior polido dicas. A partir de meados do lado direito do embrião, trabalhar o seu caminho em direção à cauda e, em seguida, até o final anterior. Depois, repita o procedimento no outro lado. Tenha cuidado para não arrancar a DRG associados.
- Para retirar completamente o cabo soltou da coluna vertebral do embrião, pegar seu cérvicoal peça com uma pinça fina e puxe-o em uma única peça para o seu fim caudal.
- Submergir o cabo isolado da coluna vertebral com DRG anexado em um poço da placa de 12 bem preenchido com tampão de fixação e prosseguir com a preparação de medulas espinhais dos embriões restantes.
- Fix medula espinhal pelo menos duas horas no gelo.
2. DII-rotulagem de neurônios DRG
- Para cada medula espinhal para ser rotulado, prepare duas agulhas de vidro com um puxador de micropipeta. Nós usamos um modelo de Sutter extrator P-97 eletrodo (configuração do programa: 1 HEAT = 625, VEL = 35 TEMPO = 175; 2 HEAT = 600, VEL = 25 TEMPO = 175; HEAT 3 = 630, = VEL... 30 TIME, = 150).
- Sob controle microscópico molhe a ponta de cada agulha de vidro 3-5 vezes em uma solução de 5% (w / v) de DII em etanol. Evaporação do etanol cria uma fina camada de cristais de DII na agulha.
- Trabalhando sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de aproximadamente 40x, coloque uma medula espinhal com seus vlado entral up em um slide. Usando uma tesoura primavera, abrir a cabo no lado ventral em todo o seu comprimento cortando o floorplate para permitir a posterior montagem da preparação em um modo de livro aberto invertido (ver secção C).
- Posição da medula espinhal com o lado dorsal até em um slide. Em seguida, manualmente abordagem o cabo com a ponta coberta de DII da agulha de vidro sob visualização microscópica e cuidadosamente furar DRG cada segundo de um lado da medula espinhal. Quase nenhum vestígio de DII deve ser visível no DRG perfurado para garantir a rotulagem de apenas um pequeno número de neurônios. Dê uma segunda agulha para o outro lado do cabo. Visando apenas a cada segundo DRG evita uma sobreposição de rotulados projeções axonal da DRG vizinhas que podem complicar a diferenciação de axônios individuais.
- Retorno da medula espinhal para o buffer de fixação e incubar no escuro por pelo menos seis horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C para dar tempo para o corante para diffuse ao longo do axônio dentro da membrana plasmática. Permitir, por um período de incubação mais longo (até dois dias a 4 ° C) se a análise de crescimento garantia para a medula espinhal é desejada.
3. Análise microscópica de montagem e
- Seguintes corante difusão posição, um único cabo spinal com o lado dorsal para baixo em uma lamela em uma gota de PBS. Tome cuidado para que o DRG anexados são corretamente orientados lateralmente e não se misturam. Aspirar o excesso de fluido e achatar o cabo em um modo de livro aberto invertido com a pinça.
- Monte a preparação sobre uma lâmina de microscópio usando PBS.
- Para evitar o aumento indesejado de análise de fluorescência de fundo coloração microscópica de rotulados projeções axonal deve ser realizada no dia da montagem. Até então, manter os slides no escuro a 4 ° C.
4. Resultados representativos:
A medula espinhal do rato recebe pr aferentesojections de 8 pares de colo do útero, 13 pares de torácicos, 5 pares de pares lombar e sacral DRG 4 de um total de 60 gânglios espinhais. Depois de algum treino uma medula espinhal com a maioria dos DRG ainda ligado pode ser isolado de um embrião em menos de cinco minutos. Este procedimento é adequado para o isolamento de medulas espinhais com DRG em anexo a partir de embriões E13.5 E11.5 para mouse. No entanto, melhores resultados são obtidos a partir E12.5. Resultados exemplar do processo de rotulagem descritos aqui são mostrados na Figura 3. A rotulagem dos DRG em toda a extensão da medula espinhal podem então ser usados para quantificar o comportamento de ramificação axonal em diferentes níveis vertebrais (Fig. 4).
Figura 1. Esquema representando os dois principais modos de ramificação axonal. (A) Desvios pelas atividades do cone de crescimento que poderia levar a uma bifurcação - como indicado aqui - assim como arbors terminal complexos ou(B) formação de colaterais no eixo axônio (intersticial ramificação). O último modo é o tipo dominante de ramificação de projetar axônios corticais e tálamo-cortical 6,7.
Figura 2 projeções aferentes dos neurônios DRG para a medula espinhal embrionárias mostrar os dois tipos de ramificação axonal:. Axônios primeira filial na DREZ pela bifurcação (1) e da forma filha ramos colaterais resultantes após um período de espera por intersticial ramificação (2).
Figura 3. Visualização de trajetórias individuais axonal de neurônios DRG embrionárias mouse. (A) da medula espinhal com DRG anexado preparados a partir de um embrião de rato E12.5. (Barra Escala, 1 mm.) (BD) vistas dorsal da DII marcado DRG de camundongos selvagens com ampliação crescente são mostrados. Em B a cada DRG segundo é labeled por DII. Imagens de fluorescência são invertidos, caudal está à esquerda e em C e D, lateral está no fundo. Em C um pequeno número de axônios é rotulado e em maior ampliação da presença de T-like ramos podem ser identificados no DREZ da medula espinhal. (Escala de barras, 250 mM (B), 100 mm (C) e 50 mm (D).)
Figura 4. Quantificação dos ramos em forma de T, única gira rostral ou caudal no tipo selvagem e C-peptídeo natriurético do tipo (CNP) camundongos deficientes em E13.5. O número de axônios única contados são dadas entre parênteses para os níveis de tronco diferentes para cada genótipo. C-ou-R voltas - o crescimento somente na direção caudal ou rostral, respectivamente.
Figura 5. A GMPc desencadeia sinalização bifurcação axônio sensorial na DREZ da medula espinhal. (A) Esquema dea via de sinalização composta cGMP do ligante CNP, o receptor de guanilato ciclase Npr2 ea serina / treonina quinase cGKIα em neurônios DRG embrionárias. Npr2 gera cGMP de GTP com a estimulação pelo CNP. (B) Dii rastreamento de axônios única de neurônios DRG em camundongos wild-type e CNP-deficiente. (Barra Escala, 25 mm.)
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Discussão
Padrões estereotipados de projeção composto por dois tipos de formação ramo axonal juntamente com facilidade de preparação em combinação com o uso de tecido fixo para DII rotulagem faz o cabo embrionárias espinhal com DRG anexado um modelo favorável ao estudo axonal ramificação. A aplicação de pequenas quantidades de DII usando agulhas de vidro revestido permite - em contraste com a rotulagem grosso do DRG - a visualização de pequenos grupos de neurônios DRG e, assim, a análise de axônios individuais e seus padrões de r...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) para comentários úteis. Este trabalho foi financiado pelo centro de pesquisa colaborativa (SFB665) do Conselho de Pesquisa Alemã (DFG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comments (opcional) |
| Estereomicroscópio Stemi RDC | Zeiss | ||
| Solução tampão fosfato (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldeído | Merck | 8.18715.1000 | |
| Tesoura cirúrgica padrão | Multa Ferramentas Ciência | 14001-13 | |
| Dentada forceps padrão | Multa Ferramentas Ciência | 11021-14 | |
| Extra fino tesoura de íris | Multa Ferramentas Ciência | 14088-10 | |
| Fórceps curvos | Multa Ferramentas Ciência | 11003-13 | |
| Dumont No.5 multa forceps dicas | Multa Ferramentas Ciência | 11254-20 | |
| Dumont No.5 acabamento espelhado forceps | Multa Ferramentas Ciência | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen Primavera tesoura | Multa Ferramentas Ciência | 15008-08 | |
| Papel-filtro | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | Precisão Instrumentos mundo | SYLG184 | |
| 100-mm placas de Petri | Greiner | 663102 | |
| 12 ml de tubos de polipropileno | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12 placa de cultura bem | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Etanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming / Brown micropipeta extrator P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Vidro borosilicato capilares | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DII (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscópio slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Tampa de vidro desliza | Carl Roth GmbH | 1870,2 |
Referências
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
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- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
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- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
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Reimpressões e permissões
