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Summary

Neste relatório, nós descrevemos como ressonância de plasma de superfície é usado para detectar a entrada de toxinas para o citosol host. Este método altamente sensível pode fornecer dados quantitativos sobre a quantidade de toxina citosólica, e pode ser aplicado a uma variedade de toxinas.

Abstract

Toxinas AB consistem de uma subunidade enzimática A e uma célula de ligação da subunidade B ^1. Estas toxinas são secretadas para o meio extracelular, mas agir de acordo com as metas dentro do citosol eucarióticas. Algumas viagens AB toxinas pelas transportadoras vesícula da superfície da célula para o retículo endoplasmático (ER) antes de entrar no citosol ^2-4. Na ER, o dissocia catalítico Uma cadeia do resto da toxina e se move através de um canal condutor de proteína para atingir o seu objectivo citosólica ^5. O translocados, a cadeia A citosólica é difícil de detectar porque o tráfico de toxinas para o ER é um processo extremamente ineficiente: a toxina mais internalizado é encaminhado para a lisossomos para degradação, portanto, apenas uma pequena fração da superfície-bound toxina atinge o aparelho de Golgi e ER ^{6 -12.}

Para monitorar a translocação da toxina da ER para o citosol em cultura de células, nós combinamos um protocolo de fracionamento subcelular com o highly método de detecção sensível de ressonância plasmon de superfície (SPR) ^13-15. A membrana plasmática das células tratadas com a toxina é seletivamente permeabilizadas com digitonina, permitindo cobrança de uma fração citosólica que posteriormente é perfundido durante um sensor de SPR revestido com uma toxina anti-Um anticorpo cadeia. O sensor de anticorpos revestido pode capturar e detectar pg / mL quantidades de toxina citosólica. Com este protocolo, é possível acompanhar a cinética de entrada de toxinas para o citosol e caracterizar efeitos inibitórios sobre o evento de translocação. A concentração de toxina citosólica também pode ser calculado a partir de uma curva padrão gerada com quantidades conhecidas de A cadeia de padrões que foram perfundidos sobre o sensor. Nosso método representa uma resposta rápida, sensível sistema de detecção e quantitativas que não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina alvo.

Protocol

1. Preparação de digitonina

1. Adicionar 500 mL de etanol a 100% para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo em um bloco de aquecimento fixado em 80 ° C por 10 min.
2. Dissolver 2,5 mg de digitonina em 250 mL de etanol aquecido para produzir uma solução estoque de 1% do digitonina.
3. Para gerar uma solução de trabalho de digitonina 0,04%, adicionar 40 mL da solução estoque para 960 mL digitonina de HCN tampão (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl _2, 10 mM N-etilmaleimida, e um inibidor de protease cocktail).

2. Intoxicação celular e permeabilização

Nosso ensaio translocação pode ser aplicado a uma variedade de toxinas e linhas celulares. Abaixo, fornecemos um protocolo detalhado para a detecção de toxina da cólera (CT). Uma visão geral do processo é fornecido na Figura 1.

1. Células HeLa são semeados em 6 bem-placas contendo 1 mL DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibiótico antimicóticopara alcançar 1×10 ⁶ células / poço após uma incubação overnight a 37 ° C. Para gerar a toxina citosólica suficiente para a detecção reprodutível, poços triplicado são necessários para cada condição.
2. Após uma incubação durante a noite, substituir o meio de cultura com 1 mL DMEM contendo 100 ng / mL de gangliosídeo GM1. Isso aumenta o número de sítios de ligação para CT, como o receptor GM1 de CT irá intercalar na membrana plasmática das células expostas a uma solução de GM1.
3. Após incubação de 1 hora a 37 ° C, remova a mídia contendo GM1 e lavar as células duas vezes com DMEM. Em seguida, coloque as células a 4 ° C por 30 min em 1 mL DMEM contendo 1 mg / mL de CT.
4. Remover o meio-toxina contendo, lave as células duas vezes com DMEM, e incubar as células em 1 mL DMEM a 37 ° C para o intervalo de tempo desejado (s).
5. No final de cada período de perseguição, lavar as células com PBS e incubar cada poço com 250 mL de 0,5 mM EDTA em PBS. Permitir que as células se sentar por 10 min à temperatura ambiente e depois removê-los da placa de 6 poços por trituração com um vigoroso Pipetman p1000. Depois de um bem de células tiver sido coletado, combiná-lo com o segundo eo terceiro, em seguida, bem de mesma condição. Raspadores de células também pode ser usado para coletar as células.
6. Coloque a suspensão de células combinadas dos três poços replicar (750 mL de volume total) em um tubo de microcentrífuga único, e girá-lo em uma microcentrífuga de mesa por 5 min a 5.000 x g. Pellets de células de tamanho equivalente deve ser obtido para todas as condições.
7. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 mL da solução de trabalho de 0,04% digitonina. Coloque a suspensão de células em gelo por 10 min.
8. Spin the células digitonina-permeabilizadas a 16.000 xg por 10 min em uma microcentrífuga de mesa. Alienar a fração citosol contendo sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e manter a organela contendo fração pellet.

título de "preparação> 3. Sample

1. Citosol contendo frações sobrenadante são diluídos em tampão HCN para um volume final de 1 mL. Volumes de amostra de pelo menos 1 mL são necessários para assegurar o ar é extraído do loop de amostra 500 mL antes da injeção.
2. Frações organela contendo pellet ressuspenso estão em 1 mL de HCN tampão contendo 1% Triton X-100. Além de detergente é necessário para liberar o pool de membrana-nham de toxina.
3. Padrões de toxina em concentrações de 100, 10, 1 e 0,1 ng / mL são preparadas em tampão HCN.
4. Conjuntos paralelos de frações citosólica e organela estão preparados para um experimento de controle para confirmar a fidelidade do processo de fracionamento. Frações gerados conforme descrito na Seção 2 são ressuspenso em 20 mL de tampão de amostra 4x (fração citosólica) ou 120 mL de 1x tampão de amostra (fração organela). Volumes equivalentes de cada fração são resolvidos por eletroforese em gel de sulfato de sódio dodecil poliacrilamida e sondado by análise de Western blot para demonstrar a separação de uma proteína citosólica na fração sobrenadante e um solúvel, proteína ER residente na fração pellet ^16-19.

4. SPR preparação da lâmina

1. A Reichert SR7000 Refratômetro SPR é usada para experimentos SPR.
2. Definir uma lâmina de vidro banhado a ouro com uma monocamada auto-montada no instrumento SPR. Para ativar o slide sensor, perfundir de 1:1 (v: v) solução de 0,4 M EDC e 0,1 M NHS sobre a lâmina por 10 min a uma vazão de 41 mL / min. Todas as perfusões subsequentes irão utilizar o mesmo caudal.
3. Para remover o EDC: NHS tampão de ativação, lavar a placa por 5 minutos com PBS contendo 0,05% Tween 20 (PBST). A placa contém agora amarras amida reativa devido a desoperculação pela EDC: solução NHS.
4. Perfundir um anticorpo anti-CTA sobre o slide sensor ativado com uma diluição de 1:20.000 em 20 mM de acetato de sódio (pH 5,5) por 15 min. Uma queda inicial na refração emdex unidade (RIU) serão vistos devido à mudança de pH. Isto será seguido por um aumento no RIU como o anticorpo é capturado pelos amarras amida-reativa no slide sensor.
5. Remover os anticorpos não ligados a partir do slide sensor com uma lavagem PBST 5 minutos. RIU o sinal produzido pelo anticorpo captada planalto e estabilizar, fornecendo um sinal de nova linha de base.
6. Perfundir 1 M etanolamina (pH 8,5) sobre o slide sensor para 5 min. Este bonés e inativa qualquer amarras unbound esquerdo no slide sensor.

5. SPR análise de amostras

1. Para estabelecer uma leitura inicial, PBST perfundir sobre o sensor de anticorpos revestido por 5 min.
2. Perfundir uma amostra ou padrão experimental da toxina sobre o sensor de 300 seg. Remover o ligante do buffer e PBST perfundir sobre o sensor para outra sec 200.
3. Após cada perfusão, a toxina ligada é removida do sensor por uma lavagem sec 100 com PBST, pH 5.0. Isso irá retornar o sinala sua leitura inicial básica, permitindo assim uma outra amostra a ser processada no mesmo sensor.
4. Antes de carregar uma nova amostra, empurrar uma pequena quantidade de ar através do loop de amostra para expulsar qualquer líquido residual da amostra anterior. Usando o procedimento descrito em 5,2-5,4, temos executado até 12 amostras em um slide sem perda substancial do sinal de linha de base.
5. A análise dos dados é realizada com o 2 Scrubber software, eo software Igor é usado para a preparação de figura.

6. Resultados representante

Toxina pertussis (PT) é uma toxina AB que se move a partir da superfície da célula para o ER antes de sua Uma cadeia (PTS1) entra no citosol ^{3, 12.} Conforme mostrado na Figura 2, o nosso ensaio de translocação SPR baseado poderia detectar PTS1 no citosol de células CHO intoxicado. Nenhum sinal foi gerado a partir do citosol de células unintoxicated, que confirmou o anticorpo anti-PTS1 não reagem de forma cruzada com um componente do citosol host. Ofração citosólica das células intoxicadas na presença de brefeldin A (BFA) também não conseguiu produzir um sinal positivo. BfA impede o transporte de toxinas para a translocação ER ^{6-8 site, 12, 20-25} e, assim, uma cadeia de fornecimento para o citosol. No final de cada execução, a toxina ligada é despojado do slide sensor. Este amostras permitiu múltiplas para ser exibido em um slide único sensor e, assim, desde uma comparação direta entre os resultados obtidos com diferentes condições experimentais.

CT é um outro tipo AB-, ER-translocação de toxinas ^4. Na Figura 3A, CTA1 foi detectada na fração citosólica das células HeLa CT-tratados. Este enfatizou que a nossa metodologia trabalha com vários tipos de células e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anticorpo anti-A cadeia está disponível. Nenhum sinal foi detectado quando a fração citosólica de CT células tratadas foi perfundido durante um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTB (Fig. 3B), demonstrando assim que o CTA1subunidade, mas não a célula-binding CTB pentâmero entra no citosol. Figura 3C mostra o sinal da fração organela é fora de escala em comparação com o sinal mais fraco da fração citosólica. Isto foi consistente com a ineficiência conhecida de CT transporte para o local de translocação ER ^{6, 7,} que por sua vez limita a quantidade de toxina que pode chegar ao citosol. Além disso, a fração organela contém CT holotoxin bem como ER-CTA1 localizada, de modo que o sinal resultante SPR para a fração organela é inflado pela massa adicional do holotoxin associado CTB pentâmero. Assim, não é prático para plotar dados das frações organela e citosólico na sensorgram mesmo.

Nosso ensaio pode monitorar o acúmulo dependente do tempo de toxina, translocado citosólica (Fig. 4). As células foram expostas à CT a 4 ° C, uma temperatura que permite a ligação da toxina para a membrana plasmática, mas impede a internalização da toxina associados a células. Após a removal de toxina não ligada, as células foram aquecidos a 37 ° C. Tanto o transporte de toxinas para o ER e A translocação da cadeia para o citosol pode ocorrer nesta temperatura. Nenhuma toxina foi detectado no citosol 15 minutos após o aquecimento a 37 ° C. Isso é reflexo do tempo de atraso necessário para (i) tráfico holotoxin ao ER, (ii) A / dissociação da subunidade B na ER, e (iii) Uma cadeia de exportação para o citosol. A piscina pequena de toxina citosólica foi detectada após 30 minutos a 37 ° C, e as quantidades progressivamente maiores de toxina citosólicas foram detectados após o 45 e 60 minutos de intervalo perseguição. Níveis ainda maiores de toxina citosólicos foram detectados após um intervalo de cinco horas de perseguição ^17, demonstrando assim um contínuo, entrega a longo prazo de células associadas a toxina para o citosol host.

Nosso ensaio também pode detectar a inibição da translocação de toxinas para o citosol (Fig. 5). Células tratadas com 10% de dimetil sulfóxido (DMSO), uma chaperone químico que impede a Disord térmicaEring da subunidade CTA1 isolado (T. e K. Banerjee Teter, observações não publicadas), apresentaram níveis baixos de CTA1 citosólica em comparação às células não tratadas. Desdobramento da toxina A cadeia é um pré-requisito para a translocação para o citosol ^16-18, para a estabilização DMSO induzida de CTA1 consequentemente impedido o seu movimento a partir do ER para o citosol.

A taxa de associação constante (k _a) calculado a partir de experimentos SPR é diretamente proporcional à concentração de ligante no buffer de perfusão ^{14, 15, 26.} Assim, é possível determinar a concentração de toxina citosólica a partir de um gráfico que traça o k _a valores para os padrões de toxinas como uma função da concentração de toxina. Este procedimento foi utilizado para quantificar o bloco DMSO induzida por toxina de translocação apresentados na Figura 5: a curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas de toxina foi utilizada para calcular uma citosólica CTA1 concentration de 0,3 ng / mL para células não tratadas e 0,1 ng / mL para células tratadas com DMSO (Fig. 6). A inibição da CTA1 desdobramento de DMSO, portanto, gerou uma redução de 3 vezes na translocação ER-to-citosol de CTA1.

Figura 1. Protocolo Geral. (A) As células são incubadas com a toxina AB a 4 ° C, uma temperatura que permite a ligação da toxina à superfície da célula, mas impede endocitose toxina. As subunidades A e B da toxina são representados por círculos vermelho e azul, respectivamente. (B) A toxina não ligado é removido do meio, e as células são aquecidas a 37 ° C, a fim de promover o transporte endocitose e retrógrada da holotoxin ao pronto-socorro. Holotoxin dissociação ocorre na ER, o que permite que a corrente Um isolado para entrar no citosol pela passagem através de um canal condutor de proteína (s) na membrana ER. (C) As células são tratadas com digitonina seletivamente, a fim de permeabilizar o plasmamembrana. (D) A centrifugação é usada para particionar as células em separado frações citosólica e organela. O citosol é espremido para fora da célula através dos poros digitonina gerado e está localizado no sobrenadante. O intactos, ligada à membrana organelas são encontradas na fração pellet. (E) Para detectar a piscina translocado da cadeia de toxina no citosol anfitrião, a fração sobrenadante é perfundido durante um sensor de SPR revestido com um anti-A cadeia de anticorpo.

Figura 2. Detecção de PTS1 translocação para o citosol host. Células CHO foram de pulso marcado com a 4 ° C por 30 min com 1 mg / mL da PT. As células foram então perseguidos por 3 hr a 37 ° C em meio livre de toxinas que não contenham adições (embriagado) ou 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilização da membrana plasmática com digitonina foi usado para extratos de células partição em separado e organela fracti citosólicaons. Um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-PTS1 foi usado para detectar a piscina citosólica de PTS1 a partir de células não tratadas ou BfA-tratada. PTS1 padrões foram perfundidos sobre o sensor como controle positivo, enquanto a fração citosólica das células unintoxicated foi perfundido sobre o slide do sensor como controle negativo. No final de cada execução, a amostra foi obrigado despojado do slide sensor.

Figura 3. Detecção de CTA1 translocação para o citosol host. Células HeLa pulso marcado com a 4 ° C com 1 mg / mL de CT foram perseguidos por 2 horas a 37 ° C em meio livre de toxinas que não contenham adições (embriagado) ou 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilização da membrana plasmática com digitonina foi usado para extratos de células partição em separado organela e frações citosólica. (A) As frações citosólica foram perfundidos por um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. Conhecidoquantidades de CTA foram utilizados como controle positivo, enquanto o citosol das células unintoxicated foi usada como controle negativo. (B) A fração citosólica das células intoxicadas na ausência de BfA foi perfundido durante um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTB. A purificada CTB pentâmero foi perfundido sobre o slide como um controle positivo. (C) A fração organela foi solubilizado com 1% Triton X-100 antes de perfusão mais de um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. Para fins comparativos, a fração citosólica (1 volume mL final) a partir do extrato mesma célula e um padrão CTA também foram perfundidos sobre o sensor. Para todos os painéis, a amostra foi obrigado despojado do sensor no final de cada execução.

Figura 4. Cinética de CTA1 entrada no citosol. Células HeLa pulso marcado com a 4 ° C com 1 mg / mL de CT foram perseguidos por 15, 30, 45 ou 60 min a 37 ° C em toxina-livre medium. Para detectar a piscina translocado da toxina, frações citosólica de digitonina-permeabilizadas células foram perfundidos mais de um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. Padrões CTA foram perfundidos sobre o sensor também. No final de cada execução, a amostra foi obrigado despojado do slide sensor.

Figura 5. Inibição da translocação CTA1 pelo DMSO. Células HeLa pulso marcado com a 4 ° C com 1 mg / mL de CT foram perseguidos por 2 horas a 37 ° C em meio livre de toxinas que não contenham adições (embriagado) ou DMSO 10% (+ DMSO intoxicado). Para detectar a piscina translocado da toxina, frações citosólica de digitonina-permeabilizadas células foram perfundidos mais de um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. CTA padrões (100, 10, 1 e 0,1 ng / mL) foram perfundidos sobre o sensor como controle positivo, apenas a 1 e 0,1 ng / mL padrões são apresentados para fins de dimensionamento. Citosol de unintoxicated células foi usada como controle negativo. No final de cada execução, a amostra foi obrigado despojado do slide sensor.

Figura 6. Cálculo do CTA1 citosólica. K _a valores das normas CTA da Figura 5 foram plotados em função da concentração da toxina. A curva resultante padrão foi usado para determinar, com base nos valores k _uma das amostras experimentais da Figura 5, a concentração de CTA1 citosólico em células não tratadas e tratadas com DMSO. Padrões de toxinas são apresentados como círculos preenchidos; citosol não tratada é apresentado como uma praça aberta, eo citosol DMSO-tratada é apresentado como um círculo aberto. As médias ± intervalos de dois experimentos independentes são mostrados.

Discussion

Comparação com a metodologia existente

Nosso ensaio translocação SPR baseado representa um método rápido, sensível, e quantitativa para detectar entrega toxina no citosol host. A técnica não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina, e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anti-toxina Um anticorpo cadeia está disponível. Métodos existentes para monitorar a passagem de toxinas para o citosol também dependem de um protocolo de fracionamento subcelular de extratos partição célula em separado citosol e frações de membrana ^{11, 23, 27, 28.} Estes métodos utilizam Western blot ou radiolabels para detectar a piscina citosólica de toxina. A primeira abordagem é semi-quantitativa na melhor das hipóteses e sofre de sensibilidade relativamente pobre. Mesmo protocolos radiomarcação pode levar semanas para gerar um resultado, devido aos baixos níveis de toxina que alcançam o citosol. Enquanto a análise quantitativa com uma toxina radiolabeled pode determinar o percentual relativode células associadas a toxina que entra no citosol, esta abordagem não pode determinar diretamente o número exato de moléculas de toxina citosólica. Comparando-se a sensibilidade de detecção de toxina SPR para a detecção de toxina radiolabeled é, portanto, problemática, como a quantidade de toxina citosólica pode ser calculado pela SPR, mas não por marcação radioactiva.

Ensaios de translocação outros passos ignorar o tráfico de upstream toxina e entregar a toxina A cadeia diretamente para o ER usando sistemas baseados em plasmídeo de expressão ou de transcrição in vitro / sistemas de tradução ^29-38. Para qualquer método, uma seqüência de sinal amino-terminal alvos da cadeia A para co-translational importação no lúmen ER. Exportação da cadeia sintetizada A partir da ER é detectada por fracionamento subcelular, centrifugação diferencial, a atividade da toxina na degradação, citosol proteosomal da toxina translocado, e / ou uma modificação toxina citosólicas específicas. Subconjuntos destas abordagens paracus unicamente em caso de translocação, podem ser usados ​​em experimentos para a reconstituição in vitro, e produzem níveis elevados de toxinas para a detecção e co-imunoprecipitação estudos. No entanto, as metodologias não pode determinar a cinética ou eficiência da prestação de toxinas da superfície da célula para o citosol. Também é possível que a cadeia de translocado A não entra na ER no mesmo estado conformacional como o holotoxin entregue cadeia A. Outros aspectos do hospedeiro toxinas interações estão faltando estes procedimentos, tais como o evento dissociação A / B. Assim, existem pontos fortes e fracos a translocação de monitoramento com um correntes que são sintetizados diretamente no ER.

Translocação da toxina muitas vezes é detectada através de ensaios de intoxicação. O efeito citotóxico ou citopático gerada pela toxina aplicada exogenamente demonstra a toxina A cadeia tem alcançado sua meta citosólica. Obviamente, esta é uma medida indireta da translocação que monitora uma toxinaCTIVIDADE no citosol e não a presença física de toxina citosólica. Assim, a técnica não pode quantificar os níveis de toxina citosólica nem detectar diretamente o processamento alterado da toxina translocado. Há também situações em que uma correlação direta entre os níveis de toxina citosólica e atividade da toxina não existem, tais como a eventual necessidade de um limiar de concentração de toxina citosólica para obter uma resposta celular ou quando a atividade da toxina produz uma resposta saturada celular. Ainda assim, os ensaios de intoxicação pode fornecer uma correlação funcional para os ensaios que diretamente documentar o evento de translocação. Nós já usou essa estratégia para demonstrar uma inibição da translocação A cadeia corresponde a uma inibição de intoxicação celular ^17-19.

Em resumo, existem vários métodos para detectar a entrega de toxinas para o citosol. Nossa abordagem baseada em SPR tem a vantagem de proporcionar resultados rápidos, sensíveis e quantitativas. O data também pode ser complementado com experimentos utilizando uma das estratégias acima mencionados mais velhos para gerar uma forte conclusão.

Aplicações futuras

Nosso método de rótulo livre para a detecção e quantificação de toxina citosólica fornece investigadores com a flexibilidade para lidar com muitas questões pendentes relativas à biologia celular de intoxicação. Por exemplo, é possível estabelecer a eficiência de uma cadeia de fornecimento para o citosol através do cálculo da percentagem de superfície-bound toxina que chega ao citosol. Também é possível quantificar o montante total de toxina citosólica e, por extensão, o número de moléculas de toxina citosólica por célula. Acredita-se que uma molécula de toxina da difteria citosólica é suficiente para provocar um efeito citopático / citotóxicos completa ^39; este modelo pode agora ser testado com outras toxinas com o nosso ensaio de translocação e ensaios intoxicação correlativos. Assim, o nosso ensaio SPR baseado em should ser capaz de determinar quantas moléculas de toxina citosólico são necessários para a intoxicação produtivo. Nossa técnica também pode acompanhar a persistência da toxina citosólica. Degradação substancial do translocado A cadeia seria limitar e possivelmente reduzir a sua concentração citosólica ao longo do tempo, o que implicaria os efeitos da intoxicação pode ser revertida se um acesso de cadeia para o citosol foi restringida após a exposição a uma toxina inicial. Além disso, o meio extracelular e membrana pellet de células intoxicado pode ser usado para controlar a quantidade de toxina secretada ou toxina que residem no sistema endomembrane, respectivamente. Estudos comparativos de toxina extracelular, endomembrane localizada, e citosólicas pode ser usado para examinar como a biologia celular de intoxicação varia para diferentes ER-translocação de toxinas. Nosso ensaio também pode ser usado para dissecar os fatores-toxina específica celulares necessários para o evento de translocação ^19. Deve ser possível adaptar nossa metodologia para acompanhara translocação endossomo-to-citosol de outras toxinas, como o fator AB antraz letal e toxina da difteria. Finalmente, a entrada do vírus no citosol anfitrião poderia ser monitorizada com um procedimento semelhante experimental.

Limitações

Condições que inibem o tráfico de toxina para o ER também irá impedir a entrega da toxina para o citosol. Isso foi demonstrado pela ausência de toxina citosólico em células tratadas com BfA (Figuras 2, 3A). Assim, experimentos de controle adicionais são necessários quando se utiliza este método para analisar blocos de potencial de translocação de toxinas. Para algumas toxinas AB, a redução de uma ligação dissulfeto que amarras da subunidade catalítica à sua holotoxin ocorre na ER ^{6, 40-43.} O estado redox da cadeia A pode, portanto, ser usado como uma medida de transporte de toxinas para a ER ^{16, 18.} Toxinas recombinantes contendo a seqüência consenso para N-glicosilação ligados, uma modificação que é iniciado na sala de emergência, também foramusado para detectar a entrada de toxinas para a ER ^{12, 23, 44-46.} Finalmente, como discutido acima, protocolos alternativos envolvendo co-translacional de inserção da toxina A cadeia no lúmen ER pode verificar um efeito inibitório sobre o evento de translocação. Por exemplo, o nosso ensaio de translocação SPR baseado demonstrado um papel funcional para Hsp90 em CTA1 translocação que foi confirmado com um sistema baseado em plasmídeo que expressa CTA1 diretamente no lúmen ER ^19.

As cadeias de ER-A translocação de toxinas exibem um forte arginina-lisina-over viés aminoácido que permite que a toxina translocado para evadir da ubiquitina-dependente degradação proteosomal ^47-50. No entanto, a degradação da toxina citosólica ainda ocorre por um relativamente lento, o mecanismo de ubiquitina-independente proteosomal ^{51, 52.} Condições que aumentam a atividade proteosomal poderia, assim, distorcer os resultados do nosso ensaio de translocação, reduzindo a piscina de toxina translocado na fra citosólicaction. Células expostas a um inibidor do proteassoma pode ser usado para controlar para essa possibilidade, um aumento de toxina citosólica da inibição da proteosomal indicaria a toxina poderia realmente chegar ao citosol, mas foi degradada antes da sua descoberta.

Note-se que estas considerações se aplicam a subconjuntos das abordagens alternativas acima mencionados e não são exclusivas ao nosso método. Como mencionado anteriormente, a melhor estratégia para caracterizar o evento de translocação é usar uma combinação de técnicas bem controlados.

Passos críticos e resolução de problemas

Preparação química é um passo crítico para o ensaio. Digitonina não se dissolve facilmente, e ele deve ser preparado para cada experimento. Da mesma forma, PBST fresco deve ser usado para a análise SPR. A EDC: NHS tampão de ativação deve ser preparada imediatamente antes de usar, não vai manter a actividade, se for armazenado depois de misturar as duas soluções. However, alíquotas separadas de EDC e do SUS podem ser armazenadas a -80 ° C e descongelado uma vez antes de usar. Todas as soluções, incluindo as amostras, devem ser isentos de gases antes da injeção. Isso vai evitar que o ar induzida por picos no sinal SPR.

O tipo de célula a ser utilizado para este ensaio deve expressam receptores de toxina suficiente para permitir uma piscina detectáveis ​​de toxina A cadeia de chegar ao citosol. Em alguns casos, como o pré-tratamento de células HeLa com GM1 antes desafio CT, os receptores de toxina adicionais podem ser adicionados à superfície das células alvo. O tipo de célula também deve ser suscetíveis a permeabilização seletiva da membrana plasmática com digitonina. O protocolo aqui descrito é eficaz com HeLa e células CHO, mas outros tipos de células vai exigir uma etapa de otimização usando análise de Western blot para monitorar a separação limpa de organela e frações citosólica. Rotineiramente, siga as distribuições de dissulfeto isomerase protéica (proteína solúvel em ER) e Hsp90 (a prote citosólicain) para este propósito ^16-19. O particionamento exclusiva de proteína isomerase dissulfureto na fração ^16-19 pellet também garante que as organelas coletados no pellet membrana estão intactos. Este é um aspecto crucial do nosso método, como a ruptura não intencional de organelas intracelulares iria introduzir erro no sistema, liberando endomembrane restrito toxina no fração citosólica. SPR baseado em experimentos também pode ser usado para demonstrar que o conjunto de resultados citosólica toxina de um evento de translocação em vez de a lise de organelas intracelulares. Por exemplo, nenhuma toxina foi detectada no citoplasma de células tratadas com BfA (Figuras 2, 3A) ou células expostas à toxina por apenas 15 minutos (Fig. 4). Da mesma forma, a subunidade B de CT não foi detectada na fração citosólica após uma exposição a uma toxina duas horas (Fig. 3B). Tivemos o nosso protocolo resultou na permeabilização de membranas internas, teríamos detectado uma piscina citosólica da toxina para cada um dos aforemencionadas condições. Que institui o protocolo apropriado para permeabilização, reprodutível seletiva da membrana plasmática é provável que representam o passo limitante para a implementação do teste. Outras opções para permeabilização de membrana plasmática estão disponíveis, mas descobrimos que o tratamento digitonina forneceu resultados mais consistentes do que outros métodos, como o tratamento com estreptolisina O.

A qualidade do anticorpo também irá determinar a sensibilidade do ensaio, que pode ser estabelecida com diluições de um padrão de toxina. Por exemplo, podemos detectar reproducibly tão pouco quanto 0,1 ng / mL de qualquer PTS1 ou padrão CTA (Figs. 2-6). O anticorpo anti-A cadeia não deve reconhecer a subunidade B da toxina, e células unintoxicated deve ser sempre usado como um controle para garantir que o anticorpo não reagem de forma cruzada com as proteínas da célula do hospedeiro. Experimentos preliminares terão de otimizar as condições para stripping toxina ligada a partir do anticorpo, pois isso pode ser diferentepara diferentes anticorpos anti-toxina.

Ao monitorar translocação toxina sob condições alteradas celular, os padrões de toxinas e fração citosólica das células controle sem tratamento deve ser complementado para corresponderem às condições da amostra experimental. Por exemplo, as normas CTA ea fração citosólica não tratada a partir da Figura 5 foram suplementados com DMSO 1% para coincidir com a concentração da droga final, na fração citosólica de células tratadas com DMSO. Isso elimina as possíveis diferenças nos sinais SPR que possam surgir a partir de diferenças na composição química das frações coletadas. Comparações entre citosólica e frações organela seria igualmente requerem a adição de 1% Triton X-100 à fração citosólica e padrões, como este detergente é usado para liberar a toxina membrana encerrados a partir da fração organela para a detecção de SPR. Experimentos preliminares têm mostrado a presença de citosol não altera a resposta SPR com os padrões de toxinas,por isso não é necessário para completar as normas de toxina com citosol de células unintoxicated.

De ligação do anticorpo para o slide sensor não irá ocorrer se o EDC: NHS solução de ativação é velho ou se o slide é inserido no aparelho com o lado de ouro baixo. Dado o processo de fabricação, haverá alguma variabilidade placa-to-plate que pode impedir EDC adequada: NHS ativação e, assim, a captura de anticorpos. Se de ligação do anticorpo para o slide é pobre, como indicado por um RIU fracamente elevado, uma segunda injeção pode depositar mais do anticorpo sobre a placa. A RIU é uma unidade arbitrária, que varia de um experimento para outro, dependendo de quanto de anticorpos anti-toxina é depositado sobre o sensor. No entanto, as taxas de on e off permanecerá constante.

É preferível usar um Refratômetro com câmaras de perfusão dual channel, como um canal pode ser utilizado para a amostra experimental e outro canal pode ser usado para buffer de alone a fim de corrigir o desvio de linha de base possível. Quando se utiliza um instrumento de dupla câmara, garantir que o anticorpo anti-toxina só é adicionado a um dos dois canais. As amostras serão posteriormente executado através de dois canais. Com um instrumento único canal, a compensação de baseline drift envolve coleta de dados do buffer de somente o slide-anticorpo revestido antes da injeção da amostra.

Antes do início de um experimento SPR, garantir o slide sensor é definido apertado no instrumento e todos os acessórios são seguras. Vazamentos resultantes destas questões irá gerar picos de ar nos dados coletados. Vazamentos também pode ser detectada pela ausência de fluxo de resíduos, que deve estar sempre presente. Um volume de amostra maior do que o volume do loop de injeção é necessária para evitar picos de ar, bem como – por exemplo, usamos um volume de mL de amostra com um loop de injeção de 500 mL. Um valor inadequado de óleo de imersão sobre o prisma irá impedir a estabilização da linha de base signal. Outras questões relacionadas à operação do instrumento SPR são abordados no Guia do usuário e Boletins técnico fornecido pela Reichert.

Materials

Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
Ganglioside GM1	Sigma-Aldrich	G7641
CTA	Sigma-Aldrich	C2398
PTS1	List	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	Pierce, Thermo Scientific	24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22981
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-80747
Anti-CTB antibody	Calbiochem	227040
Anti-PTS1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-57639
Refractometer	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides	Reichert	13206060
Syringe pump	Cole-Parmer	780200C