Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.
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Artigo de método
Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)
Neste artigo
Resumo
Resumo
O cromossoma bacteriano pode ser utilizado para manter de forma estável de ADN estranho na gama mega-base 1. Integração no cromossoma contorna questões tais como a replicação do plasmídeo, a estabilidade do plasmídeo, a incompatibilidade do plasmídeo, e variância número plasmídeo de cópia. Este método utiliza a integrase site-specific a partir do fago de Streptomyces (Φ) C31 2,3. A integrase ΦC31 catalisa uma recombinação direta entre dois sítios de DNA específicas: attB e attP (34 e 39 pb, respectivamente) 4. Esta recombinação é estável e não revertem 5. A "pista" sequência (LP), constituído por um gene de resistência à espectinomicina, aadA (SPR), ea E. gene coli ß-glucuronidase (uidA) ladeado por sites attP foi integrado nos cromossomos de Sinorhizobium meliloti, anthropi Ochrobactrum e Agrobacterium tumefaciens em uma região intergênica, a ampC locus, eo locus Teta, respectivamente. S. meliloti é usado neste protocolo. Vectores de dadores contendo locais attB mobilizável que flanqueiam um stuffer vermelho fluorescente proteína do gene (SDP) e um gene de resistência a antibiótico também têm sido construída. Neste exemplo, o pJH110 resistente gentamicina plasmídeo é usado. O gene rfp 6 pode ser substituída com uma construção desejada utilizando Sph I e Pst I. Alternativamente um construto sintético flanqueado por sítios attB podem ser sub-clonado num vector mobilizável, tais como pK19mob 7. A expressão do gene da integrase ΦC31 (clonado a partir de pHS62 8) é conduzida pelo promotor lac, em uma ampla gama de hospedeiros mobilizável plasmídeo pRK7813 9.
Um protocolo de acasalamento tetraparental é usado para transferir a cassete de doador na estirpe LP substituindo assim os marcadores na sequência de LP com a cassete de dador. Estas células são trans-integrantes. Trans-integrantes são formados com uma eficiência típica de 0,5%. Trans-integrantes são tipicamente encontrados nos primeiros 500-1,000 colónias filtradas através da sensibilidade aos antibióticos ou azul-branco rastreio utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico ácido (X-gluc). Este protocolo contém os procedimentos de acasalamento e de seleção para criar e isolar trans-integrantes.
Protocolo
1. Produção de Cultura
- Preparar meios líquidos estéreis: TY 10 (5 g / l de triptona, extracto de levedura 3 g / l, 0,44 g / l de cloreto de cálcio hidratado), e LB 11 (10 g / l de triptona, 5 g de extracto de levedura / l, 5 g / cloreto de sódio, pH 7).
- Inocular a partir de uma única colônia: SmUW227 (S. meliloti LP-deformação: a construção será descrito em outro lugar, a estirpe detalhes de construção disponíveis mediante solicitação) () em 5 ml de TY media com 50 mg / ml espectinomicina. Inocular as seguintes estirpes em 5 ml de meio líquido LB, que complementa com o antibiótico dado: E. coli DH5a 12....
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Discussão
A técnica IMCE permite a eficiente integração de uma cassete de ADN único attB flanqueada no LP-locus de uma estirpe previamente manipulada. Uma vez que a construção desejada é clonado no lugar de rfp para criar a cassete de dador, a técnica não requer purificação de ADN e transformação subsequente, o que torna muito robusta. É crítico que controla o crescimento adequados estão incluídos, para ser determinada a resistência a antibióticos é devido à criação de trans-integrantes e outros factores não.
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Para Margaret CM Smith por gentilmente fornecer o clone integrase
Apoio financeiro de:
Genoma Canadá / Genoma Prairie
NSERC Discovery e subsídios projeto estratégico
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Estreptomicina | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Espectinomicina | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicina | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetraciclina | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Canamicina | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Agar grau bacteriológica | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Triptona | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Extracto de levedura | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Cloreto de Sódio | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Cloreto de cálcio | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Ouro Biotecnologia Inc. | G1281C1 | |
| E. coli estirpe MT616 | Disponível em cima do pedido | Também é usado fora do nosso laboratório | |
| E. coli estirpe pJC2 | Em casa, disponíveis mediante solicitação | ||
| E. coli estirpe pJH110 | Em casa, disponível por Request | ||
| SmUW227 tensão | Em casa, disponíveis mediante solicitação |
Referências
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N.
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Reimpressões e permissões
