Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.
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Artigo de método
Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento e manutenção das células T CD4 + de imunossupressores células T reguladoras (Tregs) contribuem para a tolerância periférica necessária para permanecer na homeostase imunológica com a grande quantidade de antigénios próprios e comensais e no corpo humano. Perturbações no equilíbrio entre Tregs e inflamatórias células T convencionais podem resultar em imunopatologia ou cancro. Embora a injecção terapêutica de Tregs foi mostrado para ser eficaz em modelos murinos de colite 1, diabetes tipo I 2, artrite reumatóide e doença do enxerto versus hospedeiro, 4 várias diferenças fundamentais em humanos versus rato Treg biologia 5 tem, até agora impedida a utilização clínica. A falta de um número suficiente, pureza, estabilidade e especificidade de homing terapêutico Tregs exigiu uma plataforma dinâmica do desenvolvimento Treg humana em que para optimizar as condições para a sua expansão ex vivo 6.
Aqui nós Dcircunscrever um método para a diferenciação de induzida Tregs (iTregs) a partir de um único dador de sangue periférico humano, que pode ser dividido em quatro etapas: isolamento de células mononucleares do sangue periférico, a selecção magnética de células T CD4 +, em cultura celular in vitro e fluorescência activado separação de células (FACS) de subconjuntos de células T. Uma vez que o factor de transcrição Treg assinatura P3 caixa forkhead (FoxP3) é um factor de transcrição induzida por activação em seres humanos 7 e sem outros marcadores únicos existe, um painel de combinatória de marcadores, deve ser utilizado para identificar as células T com actividade supressora. Depois de seis dias em cultura, as células no nosso sistema pode ser demarcada em naive células T, células T de memória ou iTregs com base na sua expressão relativa de CD25 e CD45RA. Como as células T de memória e naïve têm diferentes requisitos de polarização relatados e plasticidades 8, pré-triagem da população inicial de células T em CD45RA + e CD45RO + subconjuntos pode be usado para examinar essas discrepâncias. Consistente com os outros, nossa CD25 Hi CD45RA - níveis elevados de iTregs expressas FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e baixos níveis de CD127 12. Na sequência de FACS de cada população, as células resultantes podem ser utilizados num ensaio de supressor que avalia a capacidade relativa para retardar a proliferação de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-rotulado células T autólogas.
Protocolo
1. Isolamento de Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de Buffy Coat
- Adquirir uma unidade de revestimento buffy do hospital ou centro de localização nas proximidades de sangue. Nosso centro de sangue nos fornece cerca de 40-60 mL de buffy coat por unidade obtido a partir de doadores de sangue normais.
- Derrame sangue em uma garrafa de vidro esterilizada contendo 500 mL PBS estéril para diluir buffy coat. O volume final de PBS + buffy coat deve ser de 250 mL.
- Encha dez 50 mL tubos cónicos cada uma com 20 mL solução de Lymphoprep.
- Suavemente sobrepor a solução Lymphoprep com 25 mL de buffy coat diluída, tendo cuidado....
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Discussão
Enquanto a transferência Treg promissora terapêutico no combate enorme rejeição do enxerto autoimunidade e outras desordens imunitárias ou inflamatórias mediadas, métodos para a sua geração eficiente e manutenção estável ainda não tenham sido desenvolvidos. Como apenas 1-5% de circulação de células T humanas são Tregs, a sua expansão controlada e diferenciação supera esta escassez como um impedimento principal da aplicação de Tregs na clínica. Por outro lado, como aprendemos com o julgamento TGN1412 13, que é.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Jennifer Strange e Greg Bauman para a sua assistência com a análise de Citometria de Fluxo e classificação. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant Número 2P20 RR020171 do NCRR e pela Universidade de Kentucky fundos de inicialização para FM; GIE agradece o apoio da Sociedade de Pós-Graduação Presidencial e da Irmandade Opportunity Kentucky.
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Materiais
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Manter a temperatura ambiente |
| Centrífuga de bancadas refrigerado | Eppendorf | 5810R | |
| Brilhante-Line hemocitômetro | Hausser Científico | 3110 | |
| CD4 + T EasySep Humanos Kit Enriquecimento celular | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Humanos da Memória + T CD4 Kit Enriquecimento celular | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Humanos CD4 + T Naïve Kit Enriquecimento celular | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magrede | Stem Cell Technologies | 18001 | Prata |
| 5 mL tubos de poliestireno de fundo redondo | BD Falcon | 352008 | |
| 15 ml de centrífuga tubos de polipropileno | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL de polipropileno de fundo redondo Tubos | BD Falcon | 352059 | |
| 50 ml de centrífuga tubos de polipropileno | VWR | 89004-364 | |
| Anticorpo anti-CD3 humano | Cell Bio X | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Bem celular placa de cultura de poliestireno | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Bem fundo redondo placa de cultura de tecidos | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 com Glutamax-I e tampão HEPES | Gibco | 72400 | |
| Soro fetal de bovino (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinante Humana TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Human IL-2 recombinante | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| EDTA 0,5 M | Amresco | E177 | |
| Rato anti-humano CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Rato anti-humano CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Rato anti-humano CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo citómetro de fluxo | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Árvore Star, Inc. | ||
| Célula Quest Software Pro | BD Biosciences | ||
| Recém-nascido Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CFSE CellTrace Kit Proliferação de Células | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Contas Inspetor de Supressão | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140 | |
| 40 estirpe celular iM Nyloner | BD Falcon | 352340 |
Referências
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V.
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Reimpressões e permissões
