O método descreve o procedimento pelo qual o squid bobtail havaiana, Euprymna scolopes E seu simbionte bacteriano, Vibrio fischeri, São levantadas separadamente e, em seguida, introduzido para permitir a colonização específica do órgão luz lula pelas bactérias. Detecção de colonização por bactérias luminescência e derivados por meio de contagem direta colônia são descritas.
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Artigo de método
Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri
Neste artigo
Resumo
Resumo
Bactérias específicas são encontrados em associação com tecidos animais 1-5. Tais host-bacterianas associações (simbiose) pode ser prejudicial (patogênicos), não tem conseqüência fitness (comensal), ou ser benéfica (mutualismo). Enquanto muita atenção tem sido dada às interações patogênicas, pouco se sabe sobre os processos que determinam a aquisição reprodutível de benéficos / comensal bactérias do ambiente. O mutualismo luz de órgãos entre a bactéria Gram-negativa marinha V. fischeri eo havaiano bobtail lula, E. scolopes, representa uma interação altamente específica em que um host (E. scolopes) estabelece uma relação simbiótica com apenas uma espécie bacteriana (V. fischeri) durante todo o curso da sua vida 6,7. A bioluminescência produzido por V. fischeri durante essa interação fornece um benefício anti-predatória de E. scolopes durante atividades noturnas 8,9, enquantoo tecido hospedeiro rico em nutrientes fornece V. fischeri com um nicho protegido 10. Durante cada geração de acolhimento, esta relação é recapitulada, representando assim um processo previsível que pode ser avaliado em detalhe em vários estágios de desenvolvimento simbiótico. No laboratório, a juvenil lula escotilha aposymbiotically (não colonizada), e, se recolhida dentro dos primeiros 30-60 minutos e transferida para simbionte livre de água, não podem ser colonizados excepto por o inoculo experimental 6. Esta interacção proporciona assim um sistema modelo útil no qual se pode avaliar os passos individuais que levam à aquisição específica de um micróbio simbiótica a partir do ambiente 11,12.
Aqui nós descrevemos um método para avaliar o grau de colonização que ocorre quando recém-eclodidos E. aposymbiotic scolopes são expostos a (artificial) a água do mar que contêm V. fischeri. Este ensaio simples descreve a inoculação, a infecção natural, e recuperaçãodo simbionte bacteriano do órgão luz nascente da E. scolopes Care. é levado para proporcionar um ambiente consistente para os animais durante o desenvolvimento simbiótico, especialmente no que diz respeito à qualidade da água e sinais de luz. Métodos para caracterizar a população simbiótico descrito incluem (1) medição da bioluminescência bactérias derivados, e (2) colônia contagem direta de simbiontes recuperados.
Protocolo
1. Preparação de inóculos
- Dia 0
Dois dias antes da inoculação lula, o prato de cepas bacterianas relevantes sobre LBS 13 ágar. - Incubar as bactérias em 25-28 ° C durante a noite.
- Dia 1
Inocular 3 ml de meio LBS em um tubo de vidro com uma cultura de cada colônia V. fischeri linhagem de infecção. Prepare duplicar tubos como backup. - Dia 2
(Coordenar passos bacterianas 1,4-1,6 com passos de lula 3.7-3.10)
1 h antes da inoculação, as bactérias subcultura 1:80 (37,5 ul) em 3 lbs ml num tubo de cultura de vidro e cresce....
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Discussão
O ensaio de colonização descrito permite a análise de um processo natural simbiótica num ambiente controlado de laboratório. Como tal, pode ser usado para avaliar a colonização por estirpes mutantes, por diferentes isolados naturais, e sob regimes químicas diferentes. Variações sobre os experimentos descritos são comumente usados para avaliar diferentes aspectos da simbiose. A cinética da colonização pode ser medido por análise de luminescência durante as primeiras 24 h, o que pode ser detectado automaticamente num co.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem Mattias Gyllborg para squid apoio instalações e dos comentários deste manuscrito, Michael Hadfield eo Kewalo Laboratório Marinho de assistência durante a coleta de campo, e os membros do Laboratório de Ruby e McFall-Ngai para contribuições para este protocolo. Trabalho no Laboratório de Mandel é suportado pela NSF IOS-0843633.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| Tubos de Vidro Cultura, 16 mm de diâmetro | VWR | 47729-580 | |
| Tampas para tubos de cultura de vidro | Pescador | NC9807998 | |
| Espectrofotómetro visível para a determinação de OD 600 | Biowave | CO8000 | Qualquer espectrofotómetro capaz de medir OD 600 irá funcionar. Esta unidade pode medir a OD 600 de líquido directamente nos tubos de cultura de vidro. Alguns ajustamento do cálculo inoculo pode ser necessário, dependendo do instrumento utilizado. |
| GloMax 20/20 Luminometer Único-Tube | Promega | E5311 | Equivalente ao BioSystems Turner 20/20n Luminometer. Inclui o suporte do tubo de microcentrífuga. |
| GloMax 20/20 Luz padrão | Promega | E5341 | Para a calibração luminómetro. |
| Refratômetro, Handheld | Foster e Smith Aquatics | CD-14.035 | Calibrar antes de cada uso com água deionizada. Lavar depois de cada uso com água deionizada para evitar acúmulo de sal. |
| Instantânea Oceano (concentrado de água do mar artificial) | Foster & Smith Aquatics | CD-16.881 | Preparar a 35 ‰ em água desionizada, utilizando o refractómetro, seguida de filtração através de um filtro de 0,2 uM SFCA. |
| Unidade de filtração | Nalgene | 158-0020 | Surfactante livre de membrana de acetato de celulose (SFCA), 0,2 m. Temos observado resultados variáveis com alguns filtros surfactante contendo PES. |
| Pipetas de transferência | Pescador | 13-711 -09:00 | Usando uma tesoura ou lâmina de barbear, cortar a ponta de forma limpa acima do rebordo primeiro para aumentar o diâmetro da ponta da pipeta e evitar espremer os filhotes de lula. |
| Descartáveis Bowls exemplo (copos de plástico) | Cometa | T9 (9 oz.) | Taças para a inoculação, com diâmetro superior 3 ¼ ", menor diâmetro 2 ¼", altura 3 ". Bowls criar um ambiente homogêneo, pois não possuem borda inferior, em que lula pode ficar preso em um nicho de baixo oxigênio. O tamanho é otimizado para 40 ml de inóculo. Disponível em webstaurantstore.com, # 619PI9. |
| Drosophila frascos | VWR | 89092-720 | Vial diâmetro corresponde a abertura na PMT luminómetro. |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Os tubos devem caber a forma dos pilões. |
| Etanol, 200 Prova | Pescador | BP2818-100 | |
| Pilões | Kimble Chase / Kontes | 749521-1500 | |
| Contas do chapeamento, 5 mm de diâmetro | Kimble perseguição | 13500 5 | Preparar 5 por tubo e em autoclave. |
Referências
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacte....
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Reimpressões e permissões
