É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Summary

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Abstract

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC) e tem sido utilizado como um modelo animal para estudo da doença desmielinizante humano, a esclerose múltipla (MS). EAE é caracterizada pela infiltração de células mononucleares patológica no SNC e pela manifestação clínica da doença paralítica. Semelhante à MS, a EAE é também sob controlo genético em que as estirpes de ratinho determinados são susceptíveis à indução da doença, enquanto outros são resistentes. Tipicamente, C57BL / 6 (H-2 ^b) ratos imunizados com proteína básica de mielina (MBP) não conseguem desenvolver sinais de paralisia. Esta falta de responsividade não é certamente devido a defeitos de processamento do antigénio ou apresentação de antigénio de MBP, como um protocolo experimental descrito aqui tinha sido utilizado para induzir a EAE grave em ratinhos C57BL / 6, bem como outros reputados linhagens mais resistentes. Além disso, os clones de células T a partir de encephalitogenic C57BL / 6 e ratinhos Balb / c reactivo a MBP tinha sido sucessototalmente isolado e propagado.

O protocolo experimental envolve o uso de um sistema de transferência adoptiva em que celular MBP-preparado (200 ug / ratinho) C57BL / 6 dadores células dos nódulos linfáticos são isoladas e cultivadas durante cinco dias com o antigénio para expandir o pool de células T específicas MBP. No final do período de cultura, a 50 milhões de células viáveis ​​são transferidos para ingénuos receptores singénicos através da veia da cauda. Ratos receptores assim tratado normalmente não se desenvolvem EAE, reafirmando seu status resistentes, e podem permanecer normais indefinidamente. Dez dias após a transferência de células, ratos receptores são desafiados com adjuvante completo de Freund (CFA)-emulsionado MBP em quatro locais nos flancos. EAE grave começa a desenvolver nestes ratinhos dez a catorze dias após o desafio. Os resultados mostraram que a indução da doença era específica antigénica como desafio com antigénios irrelevantes não induziu sinais clínicos da doença. Significativamente, uma titulação da dose de antigénio utilizado paradesafiar os ratos receptores mostraram que poderia ser tão baixa como 5 ug / rato. Além disso, um estudo cinético da temporização de desafio antigénico mostrou que desafio para induzir a doença foi eficaz tão cedo quanto 5 desafio antigénico dias pós e enquanto sobre 445 desafio antigénico dias pós. Estes dados apontam fortemente para o envolvimento de uma "longa vida" população de células T em manter indiferença. O envolvimento de células T reguladoras (Tregs) neste sistema não está definido.

Protocol

1. Preparando CFA-emulsionado Antigen

1. Dissolver cobaia MBP (preparado de acordo com o método de Swanborg1 e armazenado na forma liofilizada a 4 ° C) em solução tampão fosfato (PBS) a uma concentração de 2 mg / mL. Se péptidos MBP sintetizado (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² são utilizados, preparar uma solução a 2 mg / mL. Elaborar uma quantidade apropriada de solução de antigénio (0,1 mL por rato a ser imunizado) para uma seringa de vidro com luer-lok.
2. Elaborar um volume de adjuvante completo de Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) igual à solução de antigénio para outra seringa de vidro equipado com luer-lok.
3. Ligar as duas seringas de vidro com uma torneira de três vias. Misture a solução MBP com o CFA, empurrando os êmbolos para trás e para frente. Manter o movimento até que uma emulsão é formada.
4. Para testar se uma emulsão é formada, empurrar toda a mistura em uma seringa. Desconecte a seringa vazia, puxe tele êmbolo para trás um pouco e descarregar uma gota da emulsão residual em um copo de água limpa à temperatura ambiente. Se a queda de emulsão permanece intacta sobre a superfície da água, uma emulsão é formada. Se a queda de emulsão dispersa, reconectar as seringas e continuar o movimento de mistura.
5. Usar uma seringa de plástico de 1 ml para o processo de imunização para assegurar a entrega de uma dose precisa de antigénio. Para transferir a emulsão antigénio para a seringa de plástico, puxar para fora o êmbolo e inserir a seringa vazia de plástico para dentro da abertura de torneira de três vias onde a seringa de vidro anterior foi desligado como em 1,4.
6. Encher a seringa de plástico para o aro, empurrando o êmbolo da seringa de vidro. Inserir o êmbolo da seringa de plástico para trás e para empurrar para trás emulsão excesso até alcançar a 1,2 mL marca na seringa de plástico. Essa manobra garante que nenhuma bolha de ar é aprisionado no interior da seringa de plástico.
7. Remova a seringa de plástico do torneira de três vias. Attach uma agulha calibre 26 # para a seringa de plástico. Empurrar o êmbolo para a marca de 1 mL de modo a que a emulsão agora enche o volume vazio da agulha.

2. A imunização de camundongos doadores

Nota: camundongos fêmeas C57BL / 6 são normalmente injetados com antígeno emulsão em quatro locais nos flancos, seguindo os métodos originalmente concebidos pelo grupo McFarlin de ³ no National Institutes of Health. Para um investigador experiente, uma pessoa pode realizar toda a tarefa. Para os iniciantes, a ajuda pode ser solicitada de modo que uma pessoa detém o mouse ea outra pessoa faz a injeção. Alternativamente, o rato pode ser anestesiados para a injecção.

1. Segure o mouse com firmeza pela pele do pescoço e segurar a cauda entre os dedos ^ª 4 ^ª e 5 de tal forma que o tórax eo abdômen são facilmente acessíveis.
2. Coloque a agulha da seringa 1 mL de plástico a um sítio no tórax ligeiramente acima da axila direita (do mousar) e injectar 0,05 mL da emulsão antigénio por via subcutânea. Uma protuberância pouco do CFA esbranquiçado pode ser visto através da pele pálido. Repita a mesma para o local no tórax ligeiramente acima da axila esquerda.
3. Solte o rabo e segure o pé direito (do mouse), transformá-lo e mantê-lo entre ^os dias 4 e 5 dedos ^ª. Localizar o local imediatamente abaixo da nervura caso no flanco direito e injectar 0,05 mL da emulsão antigénio.
4. Solte o pé direito, vire o mouse para o outro lado e segure o pé esquerdo (do mouse) entre o 4 ^º e 5 ^º dedos. Localizar o local imediatamente abaixo da nervura caso no flanco esquerdo e injectar 0,05 mL da emulsão antigénio.
5. Alterar a uma agulha de fresco após a injecção de 10 ratinhos, ou se a agulha se torna embotada.

3. Isolamento de células dos nódulos linfáticos para cultura de tecido de 7 a 10 dias após a imunização

1. Sete a 10 dias após a imunização, sacrificar os ratinhose remover os linfonodos de drenagem. O método preferido de eutanásia é por inalação de CO _2. Após o sacrifício, coloque o mouse sobre as suas costas em uma placa de dissecção com os membros esticados e fixados à placa com os pinos. Os ratinhos são humedecidos com uma pulverização de etanol a 70%.
2. Cortar uma fenda na pele longitudinalmente no meio a partir da extremidade inferior do abdómen até ao queixo com tesouras e pinças esterilizadas.
3. Cortar o abdómen da pele a partir da área da virilha para baixo para cada perna. Descasque e fechar a pele, expondo os linfonodos inguinais.
4. Corte a pele junto a membros anteriores (esquerda e direita) para que a pele pode ser puxada para trás e fixado para baixo para expor os linfonodos axilares perto das axilas.
5. Com dois pares de pinças que trabalham em conjunto, afastar os tecidos conjuntivos e cobrindo em torno dos linfonodos inguinais. Quando os tecidos conjuntivos são limpas, colocar um par de pinças sob o nó de linfa e puxar para fora do corpo. Colocar onódulos linfáticos em uma placa de Petri 35 milímetros cheio com PBS estéril.
6. Afaste os tecidos conectivos que cobrem os dois gânglios axilares linfáticos usando dois pares de fórceps. Isolar os nódulos linfáticos e colocá-los na placa de Petri. Tenha muito cuidado para não quebrar os vasos sanguíneos que atravessam a área, como o sangramento torna identificar os linfonodos muito difícil.
7. Depois de todos os linfonodos são coletados, mova a placa de Petri para uma capa de biossegurança. Ruptura e provocar os gânglios linfáticos distante com os dois pares de pinças, moagem um contra o outro. Alternativamente, os nódulos linfáticos pode ser quebrada usando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de plástico de 3 mL pressionando contra os gânglios linfáticos na parte inferior da placa de Petri.
8. Passar o provocou linfa suspensão de células nó através de uma malha de nylon para remover as membranas e detritos.
9. Perfaz-se a linfa suspensão de células de nó para 50 mL utilizando PBS estéril. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos. Ressuspender o sedimento em meio de cultura. Faça uma c viávelell contar e ajustar a concentração de 4 x 10 ⁶ células / ml. UseRPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio MEM, 0,1 mM de MEM não-aminoácidos essenciais, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 10 mM de tampão Hepes e 5 x 10 ^-5 M 2-ME. Pré-aquecer a cultura antes de ressuspender as células.
10. Cultura das células em placas de 24 poços de cultura com 2 ml de volume por poço (concentração celular final de 8 x 10 ⁶ células / poço). Adicionar antigénio a cada poço a uma concentração final de 100 ug / mL. Colocar a placa de cultura num 37 ° C incubadora com 5% de CO _2. Incubar as células durante 5 dias.

4. Coleta de células cultivadas de nó de linfa 5 dias após o início das Culturas

1. Misturar as células em cada poço por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur de vidro ou de uma pipeta de pequeno volume. Colher as células para um tubo de centrífuga de 50 mL.
2. Centrifugar as células a 1000 rpm durante 10 minutos. Reanimaçãopend o sedimento de células em um pequeno volume de PBS.
3. Contar as células e ajustar a concentração de células viáveis ​​para 2,5 x 10 ⁸ células / ml com PBS estéril. Desenhar as células em uma seringa com uma agulha # 26 gauge.
4. Colocar uma lâmpada de calor sobre a gaiola de ratos receptores para ajudar a dilatar a veia da cauda.
5. Utilizando um suporte de rato, estender a cauda do rato através da fenda no suporte. Puxar para estender a cauda. Localize a veia.
6. Injectar 0,2 mL / rato da suspensão de células, igualando 5 x 10 ⁷ células.

5. Desafio antigênico de ratos receptores 20 dias a transferência de células de Correios e Desenvolvimento de sintomas da doença

1. Ratos receptores desafio que não apresentam sinais da doença com o antígeno. Os procedimentos são o mesmo que a secção 2 em "imunização de ratinhos dadores".
2. Observar o desenvolvimento de doença paralítica 7 a 10 dias após o desafio antigénico.
   1. Doença começa com fraqueza na cauda. A doença é classificada como umaquando a cauda flácida torna-se. A doença é classificada como 2 quando o mouse está paralisado em um dos membros posteriores. A doença é classificada 3, quando ambos os membros posteriores estão paralisados ​​e arrasta o mouse ambos os membros posteriores ao rastrear a frente. A doença é grau 4 quando o mouse perde o uso de ambos os membros anteriores, deixando o mouse totalmente imóvel. A doença é classificada 5, quando o mouse está moribunda eo corpo se enrola. A morte é classificada como grau de doença 6 ^4.
3. MBP-específico EAE induzida em camundongos C57BL / 6 após este protocolo é monofásica. Os ratos podem se recuperar da doença, mas não sofrem recaídas espontâneas.

6. Os resultados representativos

Os ratos que receberam ferrado e in vitro-expandidos doadores células dos nódulos linfáticos não desenvolveram sintomas da doença EAE, reflectindo a sua resistência à indução da doença. No entanto, a doença grave desenvolvido após o desafio antigénico (Tabela I), demonstrando a capacidade do desafio antigénicoem reverter o mecanismo de resistência. Duas características especiais do desafio antigênico observado são as doses de antígeno e cinética de desafio para induzir a doença. Dose muito baixa de antigénio é necessário, como mostrado na Tabela III. Surpreendentemente, os ratinhos que receberam células de dadores um ano antes pode ainda desenvolver uma doença grave quando desafiado com o antigénio (Tabela IV). Estas duas observações sugerem fortemente o envolvimento de "longa duração" células T em manter a resistência EAE. Este protocolo é aplicável a muitos EAE linhagens resistentes ^4.

Figura Fluxograma 1. Do projeto experimental para a indução de EAE em reputados linhagens mais resistentes.

		EAE clínica após a transferência adotiva			<strong> EAE Clínica após o desafio antigénico
Tensão	Antígeno	incidência	Av. grau de doença (Intervalo)	Av. dia de início (Intervalo)	Incidência	Av. grau de doença (Intervalo)	Av. dia de início (Intervalo)
SJL	MBP	21/21	4.0 (3-5)	8.0 (6-10)	ND	ND	ND
C57BL / 6	MBP	0/10	–	–	7/7	3.85 (3-5)	9.28 (9-10)
Balb / c	MBP	0/7	–	–	5/5	3.2 (3-4)	7.0 (7)
C3H/HeJ </td>	MBP	0/7	–	–	4/4	3.2 (3-4)	8.0 (8)
C57BL / 6	MBP 60-80	0/4	–	–	4/4	2.75 (2-4)	10.2 (9-11)

Tabela I. Indução de MBP-mediada EAE em ratinhos C57BL / 6. A transferência adoptiva de EAE preparado e em células in vitro-expandidos dadores não induziu nos C57BL / 6 ratinhos. Antigênica desafio de transferência de célula pós prestados os ratos suscetíveis à indução da doença. Av., Em média. ND, não feito.

		EAE clínica após o desafio antigénico
Antigen Priming	Antígeno Desafio	Incidência	Av. grau de doença (Intervalo)	Av. dia de início (Intervalo)
MBP-CFA	CFA sozinho	0/3	–	–
MBP-CFA	OVA-CFA	0/3	–	–
MBP-CFA	MBP-CFA	3/3	4.0 (4.0)	7.7 (7-9)

Tabela II Especificidade. De desafio antigênico. Ratinhos receptores foram desafiados com o antigénio de escorvamento, bem como outros antigénios irrelevantes. Apenas o antigénio de escorvamento induzida doença grave. OVA: ovalbumina de galinha. Av., Em média.

<tbody> <td> 16 (14-18)

		EAE clínica após o desafio antigénico
Desafio doses de antígeno (mg / rato)	Incidência	Av. grau de doença (Intervalo)	Av. dia de início (Intervalo)
200	4/4	3.75 (3-4)	8.25 (7-9)
100	4/4	3.67 (3-4)	7.5 (7-8)
50	4/4	3.25 (3-4)	8.25 (7-10)
25	4/4	3.0 (3.0)	8.25 (8-9)
10	4/4	3.0 (3.0)	8.76 (8-9)
5	4/4	2.5 (2-3)	9.75 (9-10)
1	2/4	1.0 (1.0)
0	0/4	–	–

Tabela III. Doses de antigénios Desafio necessária para a indução da doença. Várias concentrações de MBP utilizados para desafiar ratinhos receptores foram testados. Av., Em média.

		EAE clínica após o desafio antigénico
Antígeno Desafio	Dia do Desafio	Incidência	Av. Grau de doença (Intervalo)	Av. Dia de início (Intervalo)
MBP-CFA	5	3/4	1.33 (1-2)	9.67 (9-10)
MBP-CFA	10 </td>	4/4	3.0 (3.0)	8.25 (7-9)
MBP-CFA	15	4/4	3.75 (3-4)	7.25 (7-8)
MBP-CFA	25	4/4	4.0 (4.0)	8.0 (7-9)
MBP-CFA	35	4/4	3.5 (3-4)	7.5 (7-8)
MBP-CFA	60	4/4	3.75 (3-4)	9.0 (8-10)
————————–
MBP-CFA	343	3/3	3.0 (3.0)	10.33 (10-11)
MBP-CFA	445	3/3	3.0 (3.0)	7.0 (7.0)

Tabela IV. Cinética de desafio antigênico. Camundongos receptores foram desafiados, em diversos ponto do tempo pós adotarive transferência de células. Av., Em média.

Discussion

Estudos de EAE em ratinhos frequentemente utilizar os neuroantigens e proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídeo (PLP) ou proteína de mielina oligodendrócito (MOG). Estudos anteriores usado principalmente MBP. PLP estimula respostas fortes e consistentes de camundongos SJL. Mais recentemente, é o MOG neuroantigen comum utilizado porque ratinhos B6 são susceptíveis à indução da doença com este antigénio. Muitos dos genes alvo são as estirpes de rato no fundo B6 genética. Curiosamente, ratinhos B6 são susceptíveis à indução com EAE MOG mas são resistentes à indução da doença com MBP.

Muito do esforço anterior em elucidar os mecanismos de EAE centradas sobre os mecanismos de indução da doença, os efeitos da produção de citocinas ea recuperação mediada por células T reguladoras ^5-7. Como reputados EAE ratinhos resistentes podem subverter a indução da doença, por outro lado, não tinha sido amplamente investigada. Isto pode ser devido à dificuldade de quantificar unresponsiveness. Arnon ⁸ em 1981 primeiro mostrou que o tratamento de ratinhos B6 com ciclofosfamida processado estes ratos susceptíveis a EAE induzida com MBP. Outros mostraram que o tratamento com anti-interferão gama também com sucesso induzida doença em B6 e Balb / c fêmeas ^9,10. Deve notar-se que estes estudos todas orientadas não-antigénio marcadores específicos. Por outro lado, o protocolo aqui descrito concentra-se em um aspecto diferente da resistência EAE. Aqui só antigénio específico utilizado no desafio pode superar unresponsiveness EAE e permite a indução da doença. Este protocolo engloba tanto a fase de resistência EAE com a transferência adoptiva de células T activadas doadores ea fase susceptibilidade com desafio antigénico (Tabela I). As experiências podem ser projetados para estudar os fatores intrínsecos que mantêm a resistência EAE, bem como fatores que inverter esta apatia. Inicialmente, foi mostrado que EAE ratinhos resistentes foram capazes de montar respostas auto-imunes, quando imunizadoscom MBP ^4. Mais tarde, foi demonstrado que as células T encephalitogenic existia nestes ² ratinhos. Alguns estudos recentes ^11,12 mostraram que o tratamento de ratinhos B10.S com anticorpos anti-CD25 antes da imunização dos ratinhos para a proteína proteolipídeo (PLP) convertido os ratinhos a partir resistente à susceptíveis, o que implica o papel das células T reguladoras (Tregs) em manter a resistência EAE. No entanto, este não é o caso quando os ratinhos C57BL / 6 são similarmente tratado e imunizados com MBP ^13. A maioria dos ratos permanecem sem resposta. Assim, a resistência EAE pode ser multi-factorial. Postula-se que, no caso de ratinhos C57BL / 6 em resposta a MBP, a selecção do timo suprimiu a maioria das células T MBP-reactivo tal que as frequências de células T MBP-reactivas na periferia são muito baixos. Esta freqüência abaixo do limite de baixa tornaria os ratos não são capazes de responder a imunização com MBP. A dose desafio, através de mecanismos desconhecidos, é capaz de superar a questão das frequências e mount resposta um auto-imune. Outras investigações dos possíveis mecanismos que incluem o papel da IL-6 ¹² durante o desafio antigénico em que afecte a susceptibilidade de encephalitogenic à inibição por Tregs.

Materials

Guinea pig spinal cords	Rockland Immunochemicals	GP-T065	frozen
Freund’s Adjuvant, complete H37Ra	Difco Laboratories	231131
Multifit interchange-able syringe	BD Biosciences	512133
RPMI 1640	Mediatech, Inc.	10-040-CM
OVA	Sigma-Aldrich	A5503
Mice	Jackson Laboratory	B6 mice: 0000664	Bar Harbor, Maine