Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

Resumo

Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.

Resumo

Diferenciação direta de células tronco embrionárias (ES), as células em neurônios funcionais motoras representa um recurso promissor para estudar mecanismos da doença, para filtrar compostos de drogas novas, e para desenvolver novas terapias para doenças do neurônio motor, tais como atrofia muscular espinhal (AME) e esclerose lateral amiotrófica ( ALS). Muitos protocolos actuais usar uma combinação de ácido retinóico (RA) e hedgehog sónica (Shh) para diferenciar estaminais embrionárias de rato (MES) em células do motor neurónios ^1-4. No entanto, a eficiência de diferenciação de células de MES em neurónios do motor tem apenas um sucesso moderado. Nós desenvolvemos um protocolo de diferenciação de dois passos ^5, que melhora significativamente a eficiência de diferenciação em comparação com os protocolos actualmente estabelecidas. O primeiro passo é melhorar o processo de neuralization por adição de noggin e factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). Noggin é uma proteína morfogenética do osso antagonista (BMP) e está implicado na indução neural umae acordo com o modelo padrão de neurogênese e resulta na formação de padrão neural anterior ^6. FGF sinalização age sinergicamente com Noggin na indução de formação de tecido neural através da promoção de uma identidade posterior neural ^7-9. Neste passo, as células foram condicionadas com MES Noggin, bFGF, e FGF-8 durante dois dias para promover a diferenciação para linhagens neurais. O segundo passo é o de induzir a motor especificação neurónio. Noggin / FGFs expostas células foram incubadas com MES RA e um agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), durante mais 5 dias a fim de facilitar a motor geração neurónio. Para monitorizar a diferenciação de neurónios motores em MES, utilizou-se uma linha de células ES derivado de um ratinho transgénico eGFP expressando sob o controlo do promotor de neurónio motor específico Hb9 ^1. Usando este protocolo robusto, obtivemos 51 ± 0,8% de eficiência diferenciação (n = 3, p <0,01, teste t de Student) ^5. Os resultados de imunofluorescênciacoloração revelou que as células GFP + de expressar os marcadores neuronais específicas, a motor Islet-1 e de colina-acetiltransferase (ChAT). Nosso protocolo de diferenciação em duas fases fornece uma forma eficiente de diferenciar as células MES em neurônios motores da coluna vertebral.

Protocolo

1. Passo 1: Mouse Embryonic Stem Cultura de Células (MES) (Timing: 3 dias)

1. Plating primárias embrionárias fibroblastos de rato (PMEF)

1. Revestimento quatro 100-mm de tecido pratos de cultura com a gelatina, para adesão PMEF. Adicionar 8 ml de 0,1% de solução de gelatina (StemCell Technologies) a cada prato e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
2. Retirar o excesso de gelatina a partir de pratos. Não lave os pratos.
3. Diluir um frasco de Mitomicina C-inactivado PMEF (Millipore) que contém aprox. 5 x 10 ⁶ células em 40 ml de PMEF meios (ver receita na Tabela 1) ea placa para qua....

Discussão

A qualidade de células MES é o parâmetro mais crítico para a geração eficiente de neurónios motores. células de MES deve ser cultivado em PMEF para impedir a diferenciação espontânea. A adição de LIF ajuda a manter as células MES em um estado indiferenciado. Como as células de MES dividir cada h 12-15, o meio de cultura se torna empobrecido rapidamente e deve ser substituído por dia.

Activação eficiente da via Shh é um parâmetro crítico necessário para induzir a motor especificação neurónio........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Concentração final
PMEF	Millipore	PMEF-H	NA
PMEF médio
DMEM	Invitrogen	11965-118	NA
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamina	Invitrogen	25030-081	1%
A penicilina / estreptomicina	Invitrogen	15240-063	1%
MES médio
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cell-Qualificado FBS	Invitrogen	16141-079	15%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
Non-aminoácidos essenciais	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosídeos	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
A penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng / ml
Meio de diferenciação neural
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cult FBS	StemCell Technologies	06905	15%
Non-aminoácidos essenciais	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-tio glicerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Caneca pequena	Invitrogen	PHC1506	50 ng / ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng / ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng / ml
MND médio (diferenciação)
ES Cult-Médio-A Basal	StemCell Technologies	5801	NA
Substituição Knockout soro	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 suplemento	Invitrogen	17502-048	1%
Seu suplemento B-	StemCell Technologies	07155	1%
Ácido ascórbico	StemCell Technologies	07157	1%
A penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% em d 2 H2O
A fibronectina	StemCell Technologies	07159	5 ug / ml
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml em d 2 H2O
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Ácido Retinóico	Sigma-Aldrich	R-2625	1 uM
SAG	Merck Química	566660	1 uM
MND médio (Motor Neuron cultura)
ES Cult-Médio-A Basal	StemCell Technologies	5801	NA
Substituição Knockout soro	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 suplemento	Invitrogen	17502-048	1%
Seu suplemento B-	StemCell Technologies	07155	1%
Ácido ascórbico	StemCell Technologies	07157	1%
A penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% em d 2 H2O
A fibronectina	StemCTecnologias ell	07159	5 ug / ml
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml em d 2 H2O
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
BDNF	R & D Systems	248-BD-005/CF	10 ng / ml
CNTF	R & D Systems	257-NY-010/CF	10 ng / ml
GDNF	R & D Systems	212-GD-010/CF	10 ng / ml
NT-3	R & D Systems	267-N3-005/CF	10 ng / ml

NA = não-aplicável.

Tabela 1. PMEF e Mídia para MES cultura de células ou de diferenciação.

<> Nome forte do reagente	Companhia	Número de catálogo	Concentração Final
0,1% de gelatina	StemCell Technologies	07903	NA
Poli-DL-ornitina	Sigma-Aldrich	P0421	0,1 mg / ml em d 2 H2O
Rato laminina	Millipore	CC095	2 ug / ml em PBS
0,25% de tripsina / EDTA	StemCell Technologies	07901	NA
Accumax	Millipore	SCR006	NA

NA = não-aplicável.

Tabela 2. Reagentes para revestimento e dissociação.