Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em Drosophila Larvas

Um esboço típico dos passos experimentais para a preparação de larvas normal ou UV-sensibilizado para os dois ensaios nocicepção térmicos é mostrado na Figura 1.

1. Preparação das larvas

1. Larvas progênie macho e fêmea de um genótipo desejado pode ser testado diretamente. Alternativamente, um cruzamento genético pode ser configurado para obter larvas prole de um genótipo definido de interesse. Configure cruzes em frascos contendo alimentos mosca usando 20-30 fêmeas e machos virgens 15-20.
2. 5 dias após a postura de ovos colheita e limpa início larvas de terceiro estádio de escavar para fora a comida pastosa e mosca delicadamente esticando com água corrente através de um 630 mM (tamanho dos poros) mesh. Transferir o início larvas de terceira (~ 3-4 mm de comprimento ao longo do eixo ântero-posterior) a uma pequena almofada húmida de alimentos para evitar a fome e dessecação. Se a sensibilização nociceptiva é para ser testado, seguir os passos subsequentes 2,1-2.11. Se as larvas estão a ser testado na absence do dano tecidual, prossiga diretamente para o passo 3.1.

2. Eterização e irradiação UV

1. Construa uma câmara de eterização.
   1. Corte a parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Com uma espátula de metal quente derreter a aresta de corte do tubo de microcentrífuga.
   3. Cole uma malha fina para a superfície do tubo derretido e deixe esfriar. A câmara de eterização para permitir a entrada dos vapores do éter, mas impedir a fuga das larvas.
2. Use uma pinça ou um pincel suavemente para colocar 10 larvas no início do terceiro dentro de uma câmara eterização home-made.
3. Larvas lugar ao longo do interior da tampa e fechar.

Nota: Os dois passos seguintes devem ser realizados numa hotte como éter é um produto químico potencialmente explosiva e os seus vapores podem anestesiar um humano, bem como uma larva.

4. Coloque a câmara de eterização contendo as larvas dentro de um frasco de Coplin contendo um copo de 10 ml carregando umbola de algodão embebido com ~ 1,5 ml de éter dietílico.
5. Parafuso na tampa do recipiente Coplin para expor as larvas de vapor de éter durante 2 a 2,5 minutos. Note que os tempos mais longos eterização pode afetar comportamento larval ou de sobrevivência.
6. Após eterização, retire a câmara eterização do Coplin jar / copo, dando alguns segundos na capa para vapores do éter se dissipem. Você pode agora passar da capa para o laboratório.
7. Utilizar um frasco de esguicho de água para enxaguar levemente larvas da câmara de eterização em uma pequena placa de Petri.
8. Use uma pinça e uma Kimwipe para apagar larvas anestesiados seca e delicadamente apor-los lado dorsal em cima de uma tira de fita dupla face adesiva presa a um "x 1" 3 lâmina de vidro.
9. Colocar a lâmina sobre a superfície de fundo de uma câmara de irradiação UV e expor as larvas à luz UV durante 6 segundos a 20 mJ / cm ² intensidade.
10. Mergulhe a lâmina em água para flutuar suavemente as larvas fora do scotc dupla facefita h.
11. Use fórceps ou um pincel suavemente para colocar as larvas irradiado em um 15 45 mm x um dram frasco de cultura de vidro contendo ~ 1,0 ml de alimentos mosca onde podem recuperar durante um período de tempo variável (8 -24 horas) a 25 ° C ou temperatura da cultura outro desejado antes de re-colheita para ensaios de nocicepção térmicas.

3. Ensaio Probe local de calor

Nós entregamos um estímulo nocivo térmico a um segmento de corpo individual larval, utilizando uma sonda custom-built térmico fabricado pela Pro-Dev Engenharia (veja a tabela dos materiais). Embora esta sonda tem características de concepção ideal (uma ponta de metal pequena de ~ 0,07 área de ² mm ea capacidade de manter uma temperatura de precisamente o ponto conjunto de 23 ° C a 65 ° C), em princípio, qualquer ferramenta com uma ponta pequena que pode ser aquecido a uma temperatura definida por um período de até 20 segundos deveria ser suficiente. A ponta da sonda é utilizada para estimular precoce 3 ^rd larvas precisamente no dorsol linha média em A4 segmento abdominal (ver Figura 2). Em resposta a este estímulo térmico, as larvas irá geralmente exibem um comportamento de retirada aversivo de laminagem lateralmente por 360 graus ou mais. Este comportamento é distinto de sua resposta ao toque de luz para um não-nocivas sonda de metal em temperatura ambiente, que geralmente envolve uma breve pausa em sua ¹³ atividade locomotora.

Protocolo para o ensaio sonda de calor:

1. Pré-ajuste da temperatura da sonda térmica desejada set point.
2. Use um pincel ou uma pinça para gentilmente transferir uma larva indivíduo em uma plataforma plana (geralmente usamos um pequeno pedaço de vinil de corte de um aglutinante) em que as larvas serão posteriormente estimulado. A larva deve ser coberta por uma fina película de água antes do contacto com a sonda térmica. O filme de água cobrindo a larva deve ser tão pequeno quanto possível e cobrir completamente a larva, assegurando ao mesmo tempo que a larva não é seco ao tocar o vinil.
3. Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva no A4 segmento de aplicar a pressão de luz com a ponta em cerca de um ângulo de 45 ° entre a sonda ea superfície da larva (ver Figura 2). A pressão deve causar uma ligeira depressão na superfície da larva e será geralmente suficiente para impedir a locomoção. Se a larva continua a se mover, aplicar uma pressão um pouco mais e ele normalmente irá parar. Não registrar os dados de larvas que se movem para além do campo de visão ou para que o contato constante da sonda não podem ser alcançados até a resposta ou de corte a 20 s.
4. Continue estimulando a larva até que uma resposta de retirada é exibido ou até que o corte de 20 segundo, o que ocorrer primeiro. Respondendo larvas primeiro tipicamente mostram um comportamento preliminar de levantar a cabeça e cauda. Isto é geralmente seguido pelo comportamento de retirada de material pelo menos 360 graus. Apenas um rolo completo de 360 ​​graus é pontuada como um comportamento nocifensive (o HEA preliminard raise ou cauda não é).
5. Uma vez que o comportamento de retirada é iniciado o contato com a sonda de lançamento e gravar a latência ou o tempo para a retirada. Se nenhum comportamento é observado retirada dentro de 20 segundos, em seguida, a larva é um não-respondedor. Os respondentes pode ser dividido em 2 categorias. Se o comportamento de retirada é mostrado dentro de 5 segundos, em seguida, a larva é um fast-respondedor. Se o comportamento de retirada é mostrada entre 5-20 segundos, em seguida, a larva é um respondedor lento-(ver Figura 1 em Babcock, et al. 2009) ^1.

4. Ensaio em placa de calor global

O ensaio de calor de placas foi concebido para medir a nocicepção térmica em larvas Drosophila quando o animal inteiro é confrontado com um estímulo nocivo térmico. Indivíduo meados 3 ^rd larvas instar são colocados em uma gota 80 uL de água em um 60 15 mm x placa de Petri - ver Figura 3 para esquemática e fotografias do conjunto de ensaiopara cima. O prato Petri é então colocada sobre um bloco de aquecimento sólido (referido como "o prato de calor"). Como a temperatura dos aumentos gota de água, a larva apresenta uma série de cinco comportamentos estereotipados que denominamos thrash cabeça, rolo, chicote, convulsão e paralisia. Como estes comportamentos são, em certa medida uma função da temperatura nominal da placa de calor eo volume de água em que a larva é imerso apresentamos aqui o que nós descobrimos ser as condições óptimas (95 ° C de calor de placas, 80 uL gota de água) para a observação de todos os 5 comportamentos dos com um mínimo de sobreposição entre eles.

Protocolo para o ensaio de calor de placas:

1. Posicione as guias de luz de fibra óptica para garantir que não há iluminação suficiente contraste de alta para ver a larva. Usar uma larva de teste, se necessário. A potência da luz deve ser em baixo para evitar o calor ambiente em que a larva a ser testado.
2. Colocar o bloco de aquecimento na placa de calor com superfície plana-se e colocar a placa de calor paraa base de microscópio. Ligue o prato de calor para a posição "High", permitir que cerca de 15 minutos para a temperatura estabilizar, e ajustar em conformidade a alcançar uma temperatura de superfície de 95 ° C.
3. Medir 80 uL de água destilada e colocar a gota de água no meio de 60 a 15 milímetros de poliestireno x placa de Petri com uma micropipeta.
4. Utilize uma pinça para suavemente colocar um limpa meados 3 ^rd larva instar para o meio da gota de água. Tentar transferir a larva com o volume mínimo possível de água de modo que a gota a ser aquecido permanece tão perto quanto possível do uL 80 original.
5. Suavemente colocar a placa de Petri contendo a gota de água ea larva sobre o bloco de aquecimento sólido sobre a placa de calor. Ajustar rapidamente a posição do prato de modo a larva inteira e gota de água estão em vista. Ver Figura 3 e vídeos 1-6.
6. Iniciar o temporizador no momento da placa de Petri é colocado sobre o bloco de aquecimento sólido da placa de calor e registoo tempo de início de cada comportamento. Se desejado, os comportamentos podem também ser vídeo gravado - Ver Vídeos 1-5 para exemplos representativos de cada comportamento. Leica software versão 3.7 foi utilizado para gravar os filmes, o modo de gravação era "contínuo", câmera de resolução foi de 3 Megapixels (usamos 0.63x zoom com que a resolução da imagem calculada é de 10 mM / pixel) e quadros / segundo foram 44,5.

5. Os resultados representativos

Ensaio Probe local de calor:

Em contacto com a sonda térmica, uma larva geralmente mostra um comportamento preliminar de levantar a cabeça e cauda. Tipicamente, a elevação da cabeça é visto primeiro seguido por elevação da cauda. Alguns segundos após este comportamento preliminar da larva geralmente começa a rolar lateralmente ao qual nos referimos como o "comportamento de retirada aversivo". O tempo após o qual o comportamento preliminar ou o comportamento de retirada é mostrado pode variar conforme a temperatura ou a GEfundo magnético. No nosso estudo inicial que mediu a percentagem de larvas que apresentam retirada aversivo em diferentes temperaturas de sonda ponto de ajuste e descobriram que 48 ° C foi a temperatura mais baixa a que todas as larvas responderam rápido (<5 s). Aqui, nós relatam que há um limite para a resposta nocicepção larval térmica (Figura 4A). 100% respondedores rápidos são observados até uma temperatura da sonda de 52 ° C. No entanto, a 54 ° C e superiores, 90% ou mais das larvas não respondem mesmo após 20 s de contacto. Estas larvas não continuem se movendo após a 20 s de corte.

Como observado anteriormente ^1, as categorias de comportamento de retirada em cada temperatura podem ser plotados e comparados estatisticamente. Dado que este é um ensaio comportamental existe alguma variabilidade de larva a larva e entre os utilizadores individuais. Para explicar isso, geralmente medem 3 séries de 30 larvas por condição de teste. Para além da simples categorização de wilatência thdrawal que tenham relatado anteriormente, descrevemos aqui que a amplitude (número de rolos ou o tempo gasto no aversivo comportamento de retirada) pode também ser medida (Ver Figura 4). Surpreendentemente, parece haver uma relação inversa entre a temperatura de entrada ea robustez da resposta porque temperaturas mais baixas aparecem para provocar um maior número de rolos (Figura 4B) e mais tempo gasto na retirada aversivo (dados não mostrados). Isto pode indicar que a duração da exposição a uma temperatura nocivo pode ser o principal determinante da robustez.

Ensaio de calor de placas:

Cinco estereotipados comportamentos locomotores são observados quando da transferência da larva imersa em água à placa de calor. Estes são descritos abaixo e mostrado no vídeo juntamente com o comportamento típico de uma larva locomotora sem aquecimento em água. As latências médias em que estes comportamentos são observados são mostrados na Figura 5A, tal como são as temperaturas da água médios medidos para cada gota a latência. Sob as condições do ensaio óptimas apresentada aqui a percentagem de larvas mostrando cada comportamento distinto variou de 77 a 100% (Figura 5B), embora ocasionalmente os comportamentos de rolamento e chicotear são omitidos, sobreposição, ou ocorrer em ordem inversa. Os comportamentos observados, por ordem cronológica, são descritos como segue e pode ser visto no vídeo nos momentos a seguir indicados:

1. Movimento normal na ausência de calor: a locomoção peristáltica acompanhado por pesquisar movimentos da cabeça. Veja vídeo de 6:27.
2. Thrash cabeça: movimentos Larva cabeça rapidamente em um movimento para a frente ou lateral. Este movimento é semelhante à sua locomoção normal em água (ver vídeo 1), mas ocorre mais aos trancos e persistentemente. Veja vídeo de 6:40.
3. Roll: Larva rola lateralmente pelo menos uma completa de 360 °. Veja vídeo de 6:50. Isto pode ocorrerum número variável de vezes e, por vezes envolve rolos incompletos. Para efeitos de marcar o comportamento só contamos rolos ° 360. Este comportamento é a mais semelhante à observada com a aplicação local da sonda de calor.
4. Chicote: Larva exposições rápidas contração liberação movimentos ao longo do eixo ântero-posterior que trazer a cabeça muito brevemente perto da cauda. Veja vídeo de 7:11. Chicote é frequentemente observado em rápida sucessão ou ao mesmo tempo como a laminagem.
5. Apreensão: Larva estende ao longo do eixo ântero-posterior e apresenta uma alta freqüência de comportamento de todo o corpo tremer sem dobrar. Veja vídeo de 7:25.
6. Paralisia: Larva cessa o movimento. Em algumas larvas esta é permanente, enquanto outros, em seguida, apresentar um movimento de pulsação baixa freqüência. Veja vídeo de 7:36.

Estes dados sugerem que a temperatura da gota de água eo tempo de latência para o início do char cincocaracterística em comportamentos observados com o aquecimento global a queda de larva / água são altamente correlacionadas.

Figura 1. Esboço de medidas experimentais para a preparação e ensaio das larvas. Antes do ensaio a nocicepção com a sonda de calor, ou a placa de calor, as larvas derivado de um estoque particular ou transversal genética são colhidas e limpos de alimentos. Se a sensibilização nociceptiva (em oposição a nocicepção linha de base) é para ser apreciado, a colheita é seguido por eterização (exposição a éter), a montagem de irradiação, UV, e um período de recuperação em alimentos mosca. Larvas colhidas ou recuperados são então submetidas a temperaturas de ensaio nocivos utilizando quer a sonda de calor (local) ou a placa de calor (global) ensaio. Números referem-se a partes do texto métodos que descrevem o passo (s) mostrada.

Figure 2. Experimental criada para o ensaio de calor locais sonda. A sonda de calor é controlada por uma unidade de controlo térmico que é usado para ajustar e manter a temperatura da sonda. A sonda é realizada perpendicular ao eixo ântero-posterior e utilizado para estimular a larva a um ângulo de 45 ° com a horizontal. Contato sonda é feita especificamente no segmento abdominal A4, conforme mostrado. O usuário deve manter esse contato com uma leve pressão até o corte de 20 segundos ou até que o comportamento evolutivo começa. Se a temperatura é percebida como nociva, a larva irá mostrar um comportamento de retirada aversivo caracterizada por pelo menos um rolo de 360 ​​°. O número de rolos pode ser simples ou múltipla (ver Figura 4B).

Figura 3. Experimental set-up para o ensaio de calor de placas. (A) dos desenhos animados de uma visão horizontal da 60 15 mm x placa de Petri contendo uma média de 3 ^ªlarva estrela em uma queda de água de 80 ul. (B) dos desenhos animados de uma vista de topo da larva colocado no meio da gota de água como visto através do microscópio. (C) Fotografia de uma visão horizontal da estação de trabalho para este ensaio. (D) da fotografia da larva como visto através do microscópio.

Figura 4. Quantificação da resposta comportamental utilizando o ensaio de sonda de calor. (A) Lote de a percentagem de respondedores pertencentes a cada categoria (rápido, lento, e não-respondedores) versus temperatura. (B) Lote de latência para o comportamento de retirada aversivo versus o número de rolos de cada larva exibiram em quatro temperaturas diferentes de teste de nocividade crescentes (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, e 52 ° C).

Figura 5. Ensaio de calor de placas: Latência e Temperatura vs BehAvior. (A) a latência e temperatura queda média de água para cada resposta comportamental sob as condições óptimas de 95 ° C (temperatura da superfície quente placa) e 80 ul de gota de água (n = 150). Note-se que cada comportamento é observado dentro de um intervalo de tempo particular. Temperaturas gota de água foram medidos utilizando um termopar inserido parte superior ou inferior da gota (n = 10 gotas para cada local) e estas medições foram em média. (B) Percentagem de larvas que apresentam cada resposta comportamental sob condições de ensaio óptimas. Thrashing, apreensão e paralisia são observadas quase 100% do tempo enquanto rola e chicotear são observados 77 e 80% do tempo, respectivamente. A temperatura mais baixa apreensão conjunto superfície pontos e paralisia não são observados dentro de 200 s e em pontos mais altos do conjunto de rolamento e chicotadas podem ser ignorados ou podem ocorrer simultaneamente. n = 150. (C) Percentagem de larvas que sobrevivem após o início do comportamento paralisia. As larvas foram aquecidos até serparalisia descaroçamento e, em seguida, removido para as condições de cultura padrão para se recuperar. Mock-tratado larvas receberam tratamento equivalente, exceto para exposição ao calor. Formação de adultos pupas e viável foram quantificados em dias 7-13. n = 120.

Figura 6. Inativação de larvas nociceptivos neurônios sensoriais aumenta as latências de resposta comportamental. Trama do tempo de latência para cada comportamento para os genótipos indicados: w ^1118, Gal4 ^{109 (2) 80} = md-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, e md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. MD-Gal4 expressão unidades de UAS-regulados transgenes em todas as quatro classes de multidendritic periféricas neurónios sensoriais; UAS-Ork1.Δ-C ¹⁴ exprime uma versão modificada do aberto Drosophila rectificador canais de K + necessário para a transmissão sináptica, e U AS-Ork1.Δ-NC ¹⁴ exprime uma versão ainda mais modificada deste mesmo canal que não interfira com a transmissão sináptica. Note-se que as larvas só tendo o motorista md-Gal4 ⁶ e os transgenes UAS-Ork1.Δ-C mostram latências aumentadas para quatro dos cinco comportamentos observados (thrash, rolo, convulsões, paralisia e). Note-se também que, devido ao aumento da latência para rolar estes chicote animais antes de se enrolar. Asterisco representa p <0,05 pelo teste t de Student. n = 30 larvas para cada genótipo.

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