O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.
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Artigo de método
Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Movimento celular em resposta a estímulos externos é fundamental para muitos processos celulares, incluindo a cicatrização de feridas, inflamação e da resposta à infecção. Um método comum para medir a quimiotaxia é o ensaio de câmara de Boyden, em que as células e quimiotáticas são separados por uma membrana porosa. Como as células migrar através da membrana para o quimioatractor, aderem ao lado de baixo da membrana, ou uma descida para os meios subjacentes, e são subsequentemente corados e visualmente contadas 1. Neste método, as células são expostas a um gradiente de íngreme e transiente quimioatractor, que se pensa ser uma representação pobre de gradientes encontrados em tecidos 2.
Outro sistema de ensaio, a sub-agarose quimiotaxia ensaio, 3, 4 do movimento das células através de medidas de um substrato sólido em uma película fina que forma aquosa sob a camada de agarose. O gradiente que se desenvolve no agarose é superficial e é pensado para ser um aplicativoropriate representação de ocorrência natural de gradientes. Quimiotaxia pode ser avaliada por imagem microscópica da distância percorrida. Tanto o ensaio de câmara de Boyden eo ensaio sub-agarose são normalmente configurados como ensaios de ponto de extremidade.
O sistema ECIS / Taxis automatizado combina a abordagem sub-agarose com célula-substrato elétrica Impedância Sensing (ECIS) 5, 6. Neste ensaio, os eléctrodos alvo estão localizados em cada um de 8 câmaras. Um grande contra-eléctrodo é executado através de cada uma das câmaras 8 (Figura 2). Cada câmara é cheia com agarose e dois poços pequenos são o corte na agarose em ambos os lados do eléctrodo alvo. Um poço é preenchido com a população de células de teste, enquanto o outro mantém as fontes de quimioatraente difusora (Figura 3). Corrente passada através do sistema pode ser usado para determinar a mudança na resistência que ocorre como células passam sobre o eléctrodo de destino. Células no alvo electrode aumentar a resistência do sistema 6. Além disso, as flutuações rápidas na resistência representam alterações nas interacções de células com a superfície do eléctrodo e são indicativos de curso alterações de forma celulares. O sistema de ECIS / táxis podem medir o movimento da população de células em tempo real ao longo de períodos de tempo prolongados, mas também é suficientemente sensível para detectar a chegada de uma única célula no eléctrodo de destino.
Dictyostelium discoidium é conhecido para migrar na presença de um gradiente de folato 7, 8 e da sua resposta quimiotáctica pode ser medido com precisão por ECIS / táxis 9. Quimiotaxia de leucócitos, em resposta a SDF1α e antagonistas de quimiotaxia foi também medido com ECIS / táxis 10, 11. Um exemplo da resposta dos leucócitos a SDF1α é mostrado na Figura 1.
Protocolo
1. ECIS / Taxis Preparação do eletrodo
- A superfície de ouro do conjunto de eléctrodos ECIS / táxis (consistindo de 8 câmaras por lâmina) é primeiro estabilizada por pré-tratamento com cisteína 10 mM em água desionizada estéril (dH2O) durante 15 min à temperatura ambiente sob condições estéreis.
- Aspirar a solução de cisteína a partir de cada câmara de eléctrodo, lavar 3 vezes com dH2O estéril, e substituir com 250 uL de meio completo (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampão HEPES).
- Conecte o conjunto de eletrodos de entrar em contato com pinos titular matriz instrumento para realizar seleção de eletrodos.
- C....
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Discussão
Novas características do ensaio ECIS / Taxis incluir a sua capacidade de automatizar a coleta de dados em tempo real como as células respondem ao chemoattractant. Embora a aplicação mais comum desta tecnologia consiste em medir as respostas celulares a gradientes quimiotáticos individuais, ou aos gradientes de compostos de misturas de agonistas e antagonistas de quimiotaxia, a abordagem ECIS / táxis é também susceptível às variações de a estas configurações que podem ser bastante útil no avaliação de capacidade de respo.......
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Divulgações
David A Knecht e Michael A Lynes ter uma patente concedida para a tecnologia ECIS / Taxis, o qual foi licenciado pela Universidade de Connecticut para Aplicadas Biofísica, Inc.
Agradecimentos
Este trabalho foi suportado por concessões do National Institutes of Health (ES07408 e EB00208).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do Reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| ECIS Zθ | Biofísica Aplicada | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Matriz de | Biofísica Aplicada | 8W Quimiotaxia | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| SeaKem GTG agarose | Aplicações BioWhittaker Molecular | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone soro fetal de bovino | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin / estreptomicina | Biomedicals MP | 1670049 | A penicilina 5000 UI / ml; Estreptomicina 5 mg / ml |
| Tampão HEPES | Biomedicals MP | 1688449 | Solução 1M, grau de cultura de células |
| Calibre 14 em aço inoxidável cânula (2) 4 polegadas | Abastecimento Laboratório Geral | 5-8365-1 | Ponto Blunt |
Referências
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assa....
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Reimpressões e permissões
