Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.
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Artigo de método
Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Animais provar o ambiente à sua volta odorous através dos sistemas chemosensory localizados na cavidade nasal. Sinais chemosensory afetar comportamentos complexos como a escolha alimentar, predador, conspecific e reconhecimento mate e outras pistas socialmente relevantes. Neurônios receptores olfativos (ORNs) estão localizados na parte dorsal da cavidade nasal embutido no epitélio olfativo. Esses neurônios bipolares enviar um axônio para o bulbo olfatório (ver fig. 1, Reisert & Zhao 1, publicada originalmente no Jornal de Fisiologia Geral) e estender um único dendrito da fronteira epitelial de onde irradiam os cílios no muco que cobre o olfativo epitélio. Os cílios contêm o mecanismo de transdução de sinal que conduz finalmente à excitatórios influxo de corrente através dos canais de transdução ciliares, um nucleotídeo cíclico-gated canal (CNG) e um Ca 2 +-activated Cl - canal (Fig. 1). O que se seguiu depolarization desencadeia geração do potencial de ação no corpo celular 2-4.
Neste vídeo, descrevemos o uso da "técnica da pipeta de aspiração" para gravar odorante respostas induzidas a partir de ORNs. Este método foi desenvolvido originalmente para gravar de bastonetes 5 e uma variante deste método pode ser encontrado em jove.com modificado para gravar a partir de fotorreceptores de rato cone 6. A técnica da pipeta de sucção foi mais tarde adaptado para gravar também a partir ORNs 7,8. Resumidamente, após a dissociação do epitélio olfactivo e isolamento de células, o corpo de célula inteira de um ORN é sugado para dentro da ponta de uma pipeta de gravação. O dendrite e dos cílios permanecer exposta à solução do banho e, portanto, acessível a solução muda para permitir, por exemplo odorante ou bloqueador aplicação farmacológica. Nesta configuração, não têm acesso ao ambiente intracelular é obtida (sem fixador de tensão de célula inteira) e a tensão intracelular é livre de variar. Isso tudouxos a gravação simultânea do atual receptor lento que se origina na cílios e potenciais de ação rápidos disparados pelo corpo celular 9. A diferença na cinética entre estes dois sinais permite que eles sejam separados utilizando diferentes configurações de filtro. Esta técnica pode ser utilizada em qualquer tipo selvagem ou de rato knockout ou para gravar selectivamente a partir de ORNs que também expressam GFP para rotular subconjuntos específicos de ORNs, por exemplo, expressando um receptor de odorante dado ou canal iónico.
Protocolo
1. A configuração de gravação
A câmara de gravação é montada num microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000U com óptica de contraste de fase, que é montado em uma mesa de ar e electricamente blindado utilizando uma gaiola de Faraday. A câmara de Plexiglass gravação é composto por duas secções parcialmente separados por uma barreira e coladas sobre uma lâmina de vidro silanizado. Uma secção da câmara é usado para resolver as células, enquanto o outro é usado para o estímulo-exposição, durante a gravação de minimizar a exposição do prematuro resolvido, mas ainda não utilizadas células de odorante. A configuração de gravação é composto por uma....
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Discussão
A técnica da pipeta de aspiração é um método eletrofisiológico que é utilizado para registar o odor da corrente induzida do receptor lento e os potenciais de acção rápida a partir de um bifásicos ORN simultaneamente. Desde que a membrana plasmática da célula não seja ultrapassado, este método deixa o meio intracelular imperturbado assegurar que as respostas odorant não são alterados devido a alterações da concentração de iões no citoplasma ou de diluição de factores intracelulares. As células podem ser registados a p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH DC009613, o Programa de Ciências Humanas Fronteiras e um Morley Cuidados Fellowship (a JR).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Nome do material | Tipo | Companhia | Catálogo / Número do modelo | Comentários |
| Mesa de ar | equipamento | Newport | ||
| Bomba de ar | equipamento | Newport | ACGP | |
| Pipeta Puller | equipamento | Sutter | P-97 | |
| Vidro borosilicato | equipamento | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse microscópio invertido | equipamento | Nikon | TE2000U | Equipado com lâmpada Hg, filtro GFP e objectivos 20X e 5X pelo menos |
| Amplificador PC 501A- | equipamento | Warner | 64-0008 | Andar de entrada uma GΩ |
| Faca de diamante | Equipamento | Sob medida | ||
| Digitador Mikro1401 A / D | equipamento | Cambridge Electronic Design | ||
| Filtrar unidade 3382 | equipamento | Krohn Hite corporação | ||
| Sinalizar | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Moldado Ag / AgCl Pellet | equipamento | WPI | 64-1297 | |
| Titular da pipeta | equipamento | Warner | 64-0997 | Personalizado modificado para atender andar de entrada |
| Câmara de gravação | Equipamento | Sob medida | ||
| Micromanipulador MP85-1028 | equipamento | Instrumento Sutter | Micromanipulador MP85-1028 | |
| Óleo mineral | Solução | Sigma | 330779-1L | |
| TDS osciloscópio 1001 | equipamento | Tektronix | ||
| Três canos tubo de vidro quadrado | Equipamento | Warner | 64-0119 | 0,6 mm ID, 5 cm de comprimento |
| Válvula | equipamento | A Companhia Lee | ||
| ValveLink 8,2 | equipamento | Automatize Científico | ||
| SF-77B etapa de perfusão rápida | equipamento | Warner |
Referências
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
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Reimpressões e permissões
