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Artigo de método

Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

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DOI:

10.3791/3875

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18 de junho de 2012

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida Morsani College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo Gr-1 + Leucócitos a partir de baços de rato. Este método utiliza a citometria de fluxo e Cell AutoMACS classificação para enriquecer para viável Gr-1 + Leucócitos anteriores FACS de triagem de MDSC para uso In vivo E In vitro Ensaios.

Resumo

MDSC são uma população heterogénea de macrófagos, células dendríticas imaturas e granulócitos que se acumulam nos órgãos linfóides em condições patológicas, incluindo infecção por parasitas, inflamação, stress traumático, enxerto-versus-hospedeiro da doença, a diabetes eo cancro 1-7. Em ratinhos, MDSC expressa Mac-1 (CD11b) e Gr-1 (Ly6G e Ly6C) antigénios de superfície 7. É importante notar que MDSC são bem estudada em vários hospedeiros portadores de tumor, onde são significativamente expandidas e suprimir anti-tumorais respostas imunes homólogos em comparação com naive 7-10. No entanto, dependendo do estado patológico, existem diferentes subpopulações de MDSC com mecanismos distintos e alvos de supressão 11,12. Assim, os métodos eficazes para isolar populações viáveis ​​MDSC são importantes na elucidação suas diferentes mecanismos moleculares de supressão in vitro e in vivo.

Recentemente, o Ghansah grupo relatou a expansão do MDSC num modelo murino de pâncreas cancro. O nosso portadores de tumor MDSC exibir uma perda de homeostase e aumento da função supressora em comparação com MDSC ingénuos 13. Percentagens MDSC são significativamente menos nos compartimentos linfóides de camundongos normais vs tumor-rolamento. Esta é uma ressalva importante, que muitas vezes dificulta precisas análises comparativas destes MDSC. Portanto, enriquecendo Gr-1 + leucócitos de camundongos ingênuos antes de separação de células activadas por fluorescência (FACS) fortalece a viabilidade, pureza e reduz significativamente o tempo de classificação. Todavia, o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos de camundongos portadores de tumor é opcional uma vez que estes estão em abundância para FACS rápidas de classificação. Portanto, neste protocolo, nós descrevemos um método altamente eficiente de imunofenotipagem MDSC e enriquecendo Gr-1 + leucócitos de baços de camundongos normais para classificar MDSC em tempo hábil. Camundongos imunocompetentes C57BL / 6 são inoculadas com murino Panc02 cells subcutânea enquanto camundongos ingênuos receber 1XPBS. Aproximadamente 30 dias após a inoculação; baços são removidos e processados ​​em suspensões de célula única, utilizando uma célula de dissociação peneira. Os esplenócitos são então glóbulo vermelho (RBC) lisadas e uma alíquota destes leucócitos são coradas usando fluorocromo-anticorpos contra Mac-1 e Gr-1 a percentagens imunofenotipo MDSC utilizando citometria de fluxo. Numa experiência paralela, os leucócitos inteiras a partir de ratinhos naive são coradas com fluorescência conjugados Gr-1, incubados com anticorpos PE-micropérolas e positivamente seleccionadas utilizando uma separação de células automatizado Magnética Activado (autoMACS) Pro Separator. Em seguida, uma alíquota de Gr-1 + leucócitos são coradas com Mac-1 anticorpos para identificar o aumento em percentagem MDSC utilizando citometria de fluxo. Agora, estas GR1 leucócitos + enriquecidos estão prontos para a selecção de FACS MDSC para ser usado em análises comparativas (ingénuo vs portadores de tumor) em in vivo e in vitro

Protocolo

Antes da partida, preparar as seguintes soluções:

3% de coloração Media (SM):

-3% De soro fetal bovino (FBS) em 1X tampão fosfato salino (PBS)

MACS buffer (MB):

- 0,5% de albumina de Soro Bovino (BSA) em 1XPBS

1. Os baços de colheita de Ratos

  1. Por via subcutânea injectar 6-8 semanas de idade C57BL / 6 machos (Harlan) com 1,5 x 10 5 murinos Panc02 células em suspensão em 100 uL de PBS 1x (tumor de rolamento; TB). Camundongos controle (Naïve) recebem 100 1XPBS ul.
  2. Cerca de 4 semanas pós-injeção, eutanásia ratos por asfixia dióxido de carbono.
  3. Colheita baços de camundongos por dissecção romba com pinça e tesoura, em seguida, pesar com uma balança. Baços Coloque em separado, chamado tubos de 50 ml cônicos contendo 1 x PBS.

2. Gerar um suspensio de uma única célulan de leucócitos de baços

Todos os procedimentos devem ser realizadas em um ambiente estéril sob uma capa de segurança biológica e as células e os anticorpos mantidos em gelo.

  1. Montar a célula de dissociação peneira, inserindo a tela de malha para dentro da abertura da taça para o fundo. Em seguida, insira o anel de retenção para a área de rosca com o lado da fenda e usar o anel de chave para apertar o anel de retenção, mantendo desta forma a tela no lugar. Coloque a peneira montado numa placa de Petri contendo 10 ml de 1 x PBS.
  2. Baços de piscina e pilão de vidro utilização para moer baços contra a tela de malha de célula de dissociação peneira e para dentro da placa de Petri. Repetir para cada grupo de tratamento de ratinhos.
  3. Suspensão de células de filtro para um tubo cónico de 50 ml usando um filtro de 70 pm e uma célula pipeta de 5 ml serológico. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 1 x ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos por baço. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Parar a reacção por adição de 20 ml de 1 x PBS. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 20 ml estéril 1 x PBS. Pipetar cima e para baixo vigorosamente.
  6. Contar as células utilizando azul de tripano e um hemacitómetro e ressuspender em concentração desejada em SM 3% de modo a que 50 uL é equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml).

3. Superfície celular de coloração / Imunofenotipagem de MDSC por citometria de fluxo

  1. Rotular os poços de uma placa de fundo 96-V bem para o controlo e as amostras experimentais e manchas únicas para os controlos de compensação (nenhuma mancha, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC e DAPI).
  2. Adicionar 5x10 5-1x10 6 células equivalentes a 50 uL / poço de esplenócitos para os seus respectivos poços na placa de 96 poços de fundo em V. Centrifugarem placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  3. Preparar "Mix Master" (MM) do rato BD Fc Block (Rat anti-rato CD16/32 anticorpo monoclonal) diluída em SM 3%, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo. Como ponto de partida, usar 1 ug Bloco Fc em SM 3% para um volume final de 50 ul, por poço.
  4. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da placa de 96 poços de fundo em V por rapidamente invertendo a placa sobre e para trás, ao longo de um recipiente de resíduos ou pia sem interrupção dos peletes celulares.
  5. Vortex, brevemente centrifugar Fc MM Bloco durante 5 segundos e adicionar 50 uL a todos os peletes na placa de 96 poços de fundo em V. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo, deixando amostras em seus poços. Incubar placa durante 15 min no escuro em gelo. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  6. Preparar "Mix Master" (MM) de fluorocromo-anticorpos diluídos em SM 3% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo, enquanto as amostras incubar com o Bloco Fc. Anticorpos deve ser tituladapara determinar diluições óptimas para a coloração de procedimentos. Como ponto de partida, combinar uma diluição 1:25 do Mac-1-FITC e diluição 1:20 de Gr-1-APC em SM 3% para um volume final de 50 ul, por poço de amostra.
  7. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da 96-V bem inferior como descrito anteriormente.
  8. Vortex, brevemente centrifugar MM de anticorpos fluorescente-conjugados de coloração durante 5 segundos e adicionar 50 uL de controlo e de peletes experimentais. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Para uma única mancha compensações, adicionar uma diluição 1:25 do Mac-1-FITC, diluição 1:20 de Gr-1-APC e 75 ng / ml de DAPI, em SM 3% para um volume final de 50 uL por poço para os seus respectivos poços. Adicionar 50 ul SM 3% a imaculada bem (não mancha). Misturar bem e incubar as células na placa de 96 poços de fundo em V durante 30 min no escuro em gelo.
  9. Tubos de etiquetas FACS (5 ml, 12 mm x 75 mm de poliestireno tubos de fundo redondo) para corresponder a cada poço na placa de 96 poços de fundo em V. Adicionar 200 uL SM 3% a cada um FACStubo.
  10. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e remover os sobrenadantes. Lave pelotas pela adição de 100 ul SM 3% a cada pellet e misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. Repita o passo de lavagem mais uma vez.
  11. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da 96-V bem inferior como descrito anteriormente. Ressuspender cada sedimento em 100 SM ul 3% e misture bem.
  12. Transferir 100 uL sedimento ressuspenso a partir de cada poço da placa de 96 poços de fundo em V à sua tubo FACS respectivamente rotulado.
  13. Antes da análise de fluxo de citometria, adicionar 75 ng / ml DAPI para controlar e as amostras experimentais e de controlo de compensação DAPI única mancha.
  14. Execute o fluxo de aquisição de dados por citometria de percentagens MDSC. Execute a compensação usando o negativo (nenhum controlo mancha) e os controlos positivos individuais. Configurar um gráfico de pontos que mostra a dispersão frontal (FSC) versus lateral (SSC) em escala logarítmica, para que populações de leucócitos deinteresse pode ser identificada. Desenhe um grande portão em todos os leucócitos, excluindo detritos e aglomerados com menor dispersão para a frente e lateral. A partir deste portão principal, criar um novo gráfico de pontos que exibe SSC contra DAPI e DAPI em porta (ao vivo) células. Seleccionar esta população recém-gated e criar um gráfico de pontos que exibe Mac-1 versus Gr-1 e portão no seu positiva dupla (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Enriquecimento magnético de GR-1 + Leucócitos

  1. Alíquotas 1x10 7 restantes leucócitos não coradas em tubos adequadamente marcados FACS e centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  2. Preparar MM de Gr-1-PE anticorpo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para até 10 7 células, utilizar uma diluição de 1:10 de Gr-1-PE anticorpo em 50 MB ul, por amostra. Para um maior número de células, aumentar os volumes de acordo. Resumidamente centrifugar durante 5 segundos, adicionar aos leucócitos em tubos de FACS e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro.
  3. Adicionar 2 ml de MB para tubos de FACS, centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e elimine o sobrenadante.
  4. Preparar MM de Anti-PE micropérolas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para até 10 7 células, utilizar uma diluição de 1:4 de anti-PE micropérolas em 200 MB ul, por amostra. Para um maior número de células, aumentar os volumes de acordo. Resumidamente centrifugar durante 5 segundos, adicionar aos leucócitos em tubos de FACS e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro.
  5. Adicionar 2 ml de MB para tubos de FACS, centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e elimine o sobrenadante. Ressuspender o granulado em 3 ml de SB. Filtrar através de uma peneira iM 70 para um novo tubo ml, rotulados 50 cónico.
  6. Prepare-se e prepare Auto MACS Separador Pro. Recarga de todos os frascos com as soluções adequadas e esvaziar o depósito de resíduos, se necessário. Vire instrumento e examinar o status de recipientes de fluido e de coluna (s) após a inicialização. Todos os símbolos devem ser verdes. No menu, selecione "separação" do superiorbarra de menu, seguido de "Lavar Agora" na barra de menu inferior. Selecione "Lavar" a partir da opção pop-up, seguido de "Executar" para iniciar o processo de preparação. Uma vez que o processo de priming é concluída com êxito, o instrumento, então, mostrar que é "Ready for Separation" no menu Status.
  7. Escolha suporte de tubos refrigerados adequado para tamanhos de tubos e coloque 50 ml de tubo cônico com células marcadas magneticamente na linha A, 50 ml tubo cônico de coleta de fração negativa na linha B e 15 ml tubo cônico para a coleta de fração positiva na linha C.
  8. Escolha "POSSEL_S" programa de separação de células para seleção positiva de células alvo marcadas no modo sensível a partir de amostras. Células alvo magneticamente marcadas são retidos na coluna automáticos; células não marcadas são libertados para o tubo de recolha negativo fracção em B. Em linha de retracção automática do magneto, as células alvo marcadas irá ser libertado para o tubo de recolha positiva na linha C do tubo rack.

5. Mensagem Ordenar Análise de GR-1 Leucócitos + enriquecidos

  1. Recontagem Gr-1 + e Gr-1 - frações utilizando Trypan Blue e um hemocitômetro. Ressuspender as células em concentração desejada em meio de coloração com 3% de modo a que 50 uL é equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml) e transferir 50 uL para tubos correspondentemente rotulados FACS.
  2. Prepara-se uma MM de Mac-1 só, a uma diluição 1:25 em SM 3% para um volume final de 50 uL por amostra. Corar as células e preparar individuais compensações mancha de Gr-PE, Mac-1 FITC e DAPI para análise de citometria de fluxo. Adicionar 200 uL SM 3% e DAPI corante de viabilidade, como descrito anteriormente.
  3. Execute o fluxo de aquisição de dados por citometria de determinar Gr-1 + e Gr-1 - Percentagens e também para comparar as proporções MDSC enriquecimento pré-e pós-autoMACS.

6. Os resultados representativos

Aqui nós mostramos r resultados epresentative para autoMACS enriquecimento de Gr-1 + leucócitos a partir do conjunto, baço ingénuas para FACS subsequentes de triagem de MDSC (Figura 1). 1x10 6 leucócitos naive foram coradas com Mac-1-FITC e Gr-1-APC anticorpos para identificar percentagens MDSC usando um instrumento BD LSRII, antes de triagem autoMACS. 1x10 7 leucócitos naive foram então coradas com anti-Gr-1-PE anticorpos e PE-micropérolas para o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos utilizando um autoMACS Separator Pro. Pós-autoMACS enriquecimento, Gr-1 percentagens em Gr-1 + e Gr-1 - fracções recolhidas foram avaliados usando citometria de fluxo. 1x10 6 Gr-1 + leucócitos foram removidas e coradas com Mac-1-FITC de anticorpos para avaliar e comparar percentagens MDSC de enriquecido, pooled leucócitos virgens de não enriquecido, reunidas portadores de tumor leucócitos por citometria de fluxo.

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Figura 1. Enriquecimento AutoMACS de Naïve Gr-1 + leucócitos para FACS MDSC Ordenação. Os baços foram colhidas a partir de ratos portadores de tumor pancreático e ingénuos e transformados em suspensões de célula única. Análise de citometria de fluxo de superfície de leucócitos ingénuo coradas com Mac-1 e Gr-1 fluorescente anticorpos conjugados, antes de autoMACS enriquecimento (A). Análise de citometria de fluxo de Gr-1 + (B) e Gr-1 - (C) As fracções de enriquecimento pós-autoMACS de Gr-1 + células a partir do conjunto leuckocytes naive coradas com Gr-1-PE anticorpos e anti-PE micropérolas. Análise por citometria de fluxo de MDSC e Gr-1 + percentagens enriquecimento pós-autoMACS de Gr-1 + células a partir do conjunto de leucócitos ingênuo (D) em comparação aos não enriquecidos leucócitos obtidos a partir de camundongos portadores de tumor (E) (ratos ingênuos, n = 5 ; camundongos portadores de tumor, n = 3). MDSC e Gr-1 percentagens são fechado nos gráficos de contorno representativas e histogramas.

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Discussão

Este é um método detalhado para o processamento e immunophentyping populações MDSC que é aplicável a diferentes tecidos linfóides a partir de vários modelos animais. Em particular, o enriquecimento autoMACS pode ser usado para o isolamento de várias populações de leucócitos, incluindo Gr-1 depleção de esplenócitos 4, a purificação de subconjuntos mielóides de esplenócitos e gânglios linfáticos 5, o isolamento dos neutrófilos da medula óssea de 14 e purificação de células T CD8 +

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Reconhecemos o fluxo USF Facilidade Núcleo Citometria. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Denise Cooper para a partilha de recursos. Gostaríamos também de agradecer a Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour por sua assistência na criação e filmagens deste vídeo. NN suportado pela NSF FG-LSAMP Ponte para o Doutorado Fellowship HRD # 0929435. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional # 93-032-13/Moffitt Cancer Center, atribuído ao TG.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
REAGENTE EMPRESA Catalogo COMENTÁRIOS
Fosfato 1X Tampão Salina Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca 2 + / Mg 2 + / Vermelho de Fenol-livre
Albumina de Soro Bovino (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Deixe BSA dissolver imperturbável em PBS; ambiente estéril
Soro fetal de bovino (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Inativados pelo calor; ambiente estéril
Rat anti-rato CD16/32 anticorpo monoclonal (Fc Block) BD Biosciences 553142 Ambiente estéril
Anti-ratinho CD11b (Mac-1) FITC eBiosciences 11-0112 EstérilAmbiente
Anti-ratinho Ly6G (Gr-1) APC eBiosciences 17-5931 Ambiente estéril
Anti-ratinho Ly6G (Gr-1) PE eBiosciences 12-5931 Ambiente estéril
DAPI Invitrogen D1306 Ambiente de Diluição Estéril
A dissociação de células Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave antes do uso
70 m de filtro BD Biosciences 352350 Ambiente estéril
1X Tampão de Lise RBC eBiosciences 00-4333-57 Aquecer até à temperatura ambiente antes da utilização; ambiente estéril
As placas de Petri Fisher Scientific 08-757-12 Ambiente estéril
50ml contubos ical Thermo Scientific 339652 Ambiente estéril
5ml 12X75mm de poliestireno de fundo tubos redondos BD Biosciences 352054 Conhecido como tubos FACS; ambiente estéril
96 poços de fundo em V placas Corning 3897 Ambiente estéril
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Ambiente estéril
PE micro Miltenyi Biotec 130-048-801 Ambiente estéril
AutoMACS Separador Pro Miltenyi Biotec 130-092-545
Colunas AutoMACS Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS tampão de corrida Miltenyi Biotec 130-091-221

Referências

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