Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo Gr-1 + Leucócitos a partir de baços de rato. Este método utiliza a citometria de fluxo e Cell AutoMACS classificação para enriquecer para viável Gr-1 + Leucócitos anteriores FACS de triagem de MDSC para uso In vivo E In vitro Ensaios.
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Artigo de método
Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)
Neste artigo
Resumo
Resumo
MDSC são uma população heterogénea de macrófagos, células dendríticas imaturas e granulócitos que se acumulam nos órgãos linfóides em condições patológicas, incluindo infecção por parasitas, inflamação, stress traumático, enxerto-versus-hospedeiro da doença, a diabetes eo cancro 1-7. Em ratinhos, MDSC expressa Mac-1 (CD11b) e Gr-1 (Ly6G e Ly6C) antigénios de superfície 7. É importante notar que MDSC são bem estudada em vários hospedeiros portadores de tumor, onde são significativamente expandidas e suprimir anti-tumorais respostas imunes homólogos em comparação com naive 7-10. No entanto, dependendo do estado patológico, existem diferentes subpopulações de MDSC com mecanismos distintos e alvos de supressão 11,12. Assim, os métodos eficazes para isolar populações viáveis MDSC são importantes na elucidação suas diferentes mecanismos moleculares de supressão in vitro e in vivo.
Recentemente, o Ghansah grupo relatou a expansão do MDSC num modelo murino de pâncreas cancro. O nosso portadores de tumor MDSC exibir uma perda de homeostase e aumento da função supressora em comparação com MDSC ingénuos 13. Percentagens MDSC são significativamente menos nos compartimentos linfóides de camundongos normais vs tumor-rolamento. Esta é uma ressalva importante, que muitas vezes dificulta precisas análises comparativas destes MDSC. Portanto, enriquecendo Gr-1 + leucócitos de camundongos ingênuos antes de separação de células activadas por fluorescência (FACS) fortalece a viabilidade, pureza e reduz significativamente o tempo de classificação. Todavia, o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos de camundongos portadores de tumor é opcional uma vez que estes estão em abundância para FACS rápidas de classificação. Portanto, neste protocolo, nós descrevemos um método altamente eficiente de imunofenotipagem MDSC e enriquecendo Gr-1 + leucócitos de baços de camundongos normais para classificar MDSC em tempo hábil. Camundongos imunocompetentes C57BL / 6 são inoculadas com murino Panc02 cells subcutânea enquanto camundongos ingênuos receber 1XPBS. Aproximadamente 30 dias após a inoculação; baços são removidos e processados em suspensões de célula única, utilizando uma célula de dissociação peneira. Os esplenócitos são então glóbulo vermelho (RBC) lisadas e uma alíquota destes leucócitos são coradas usando fluorocromo-anticorpos contra Mac-1 e Gr-1 a percentagens imunofenotipo MDSC utilizando citometria de fluxo. Numa experiência paralela, os leucócitos inteiras a partir de ratinhos naive são coradas com fluorescência conjugados Gr-1, incubados com anticorpos PE-micropérolas e positivamente seleccionadas utilizando uma separação de células automatizado Magnética Activado (autoMACS) Pro Separator. Em seguida, uma alíquota de Gr-1 + leucócitos são coradas com Mac-1 anticorpos para identificar o aumento em percentagem MDSC utilizando citometria de fluxo. Agora, estas GR1 leucócitos + enriquecidos estão prontos para a selecção de FACS MDSC para ser usado em análises comparativas (ingénuo vs portadores de tumor) em in vivo e in vitro
Protocolo
Antes da partida, preparar as seguintes soluções:
3% de coloração Media (SM):
-3% De soro fetal bovino (FBS) em 1X tampão fosfato salino (PBS)
MACS buffer (MB):
- 0,5% de albumina de Soro Bovino (BSA) em 1XPBS
1. Os baços de colheita de Ratos
- Por via subcutânea injectar 6-8 semanas de idade C57BL / 6 machos (Harlan) com 1,5 x 10 5 murinos Panc02 células em suspensão em 100 uL de PBS 1x (tumor de rolamento; TB). Camundongos controle (Naïve) recebem 100 1XPBS ul.
- C....
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Discussão
Este é um método detalhado para o processamento e immunophentyping populações MDSC que é aplicável a diferentes tecidos linfóides a partir de vários modelos animais. Em particular, o enriquecimento autoMACS pode ser usado para o isolamento de várias populações de leucócitos, incluindo Gr-1 depleção de esplenócitos 4, a purificação de subconjuntos mielóides de esplenócitos e gânglios linfáticos 5, o isolamento dos neutrófilos da medula óssea de 14 e purificação de células T CD8 +
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Reconhecemos o fluxo USF Facilidade Núcleo Citometria. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Denise Cooper para a partilha de recursos. Gostaríamos também de agradecer a Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour por sua assistência na criação e filmagens deste vídeo. NN suportado pela NSF FG-LSAMP Ponte para o Doutorado Fellowship HRD # 0929435. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional # 93-032-13/Moffitt Cancer Center, atribuído ao TG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTE | EMPRESA | Catalogo | COMENTÁRIOS |
| Fosfato 1X Tampão Salina | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca 2 + / Mg 2 + / Vermelho de Fenol-livre |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Deixe BSA dissolver imperturbável em PBS; ambiente estéril |
| Soro fetal de bovino (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Inativados pelo calor; ambiente estéril |
| Rat anti-rato CD16/32 anticorpo monoclonal (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Ambiente estéril |
| Anti-ratinho CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | EstérilAmbiente |
| Anti-ratinho Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Ambiente estéril |
| Anti-ratinho Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Ambiente estéril |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Ambiente de Diluição Estéril |
| A dissociação de células Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave antes do uso |
| 70 m de filtro | BD Biosciences | 352350 | Ambiente estéril |
| 1X Tampão de Lise RBC | eBiosciences | 00-4333-57 | Aquecer até à temperatura ambiente antes da utilização; ambiente estéril |
| As placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | Ambiente estéril |
| 50ml contubos ical | Thermo Scientific | 339652 | Ambiente estéril |
| 5ml 12X75mm de poliestireno de fundo tubos redondos | BD Biosciences | 352054 | Conhecido como tubos FACS; ambiente estéril |
| 96 poços de fundo em V placas | Corning | 3897 | Ambiente estéril |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Ambiente estéril |
| PE micro | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Ambiente estéril |
| AutoMACS Separador Pro | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Colunas AutoMACS | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS tampão de corrida | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
Referências
- Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
- Zhu, B.
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Reimpressões e permissões
