Artigo de método

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

DOI:

10.3791/3906

⸱

13 de junho de 2012

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1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Resumo

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Durante a última década, o transplante de células estaminais ganhou interesse crescente como primário ou secundário modalidade terapêutica para uma variedade de doenças, tanto em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, até à data resultados referentes resultado funcional e / ou tecido regeneração transplante de células estaminais seguinte são bastante diversos. Geralmente, um benefício clínico é observado sem uma profunda compreensão do mecanismo subjacente (s) 1. Portanto, os esforços têm múltiplas levou ao desenvolvimento de diferentes modalidades de imagens moleculares para monitorar enxerto de células-tronco com o objectivo último para avaliar com precisão o destino, sobrevivência e fisiologia de células estaminais enxertados e / ou do seu ambiente de micro-. Alterações observadas em um ou mais parâmetros determinados por imagem molecular pode estar relacionado com o efeito observado clínica. Neste contexto, os nossos estudos focalizam o uso combinado de imagem de bioluminescência (BLI), ressonância magnética (MRI) e Analysi histológicas para avaliar células estaminais do miocárdio.

BLI é normalmente usado para executar de forma não invasiva de rastreamento de células e monitorar a sobrevivência das células no tempo após o transplante de 2-7, com base numa reacção bioquímica onde as células expressando o gene repórter da luciferase-são capazes de emitir luz interacção seguinte com o seu substrato (por exemplo, D- luciferina) 8, 9. RM, por outro lado é uma técnica não-invasivo que é clinicamente aplicável 10 e pode ser usado para localizar precisamente os enxertos celulares com resolução muito elevada 11-15, embora a sua sensibilidade altamente depende do contraste gerado após marcação das células com um agente de contraste para IRM . Finalmente, post-mortem análise histológica é o método de escolha para validar os resultados de pesquisa obtidos com técnicas não-invasivas com maior resolução e sensibilidade. Além disso end-point análise histológica nos permite realizar uma análise detalhada fenotípica das células enxertadas e / ou tecido circundante, based sobre a utilização de proteínas repórter fluorescentes e / ou rotulagem célula directa com anticorpos específicos.

Em resumo, estamos aqui visualmente demonstrar a complementaridade de BLI, ressonância magnética e histologia para desvendar células-tronco e diferente / ou meio ambiente associada seguintes características de células-tronco de enxerto no sistema nervoso central de camundongos. Como um exemplo, derivadas da medula óssea células estromais, geneticamente modificados para expressar o reforço de Proteína Fluorescente Verde (eGFP) e luciferase do pirilampo (FLUC), e marcadas com azul fluorescentes micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (MPIOs), vai ser enxertados na SNC de camundongos imuno-competentes e os resultados serão monitorados por BLI, ressonância magnética e histologia (Figura 1).

Protocolo

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1. Preparação de células

  1. Experiências deve ser iniciada usando ex vivo populações de células-tronco cultivadas geneticamente modificadas para expressar as proteínas repórter da luciferase e EGFP. Aqui usamos luciferase / eGFP-expressam murinos derivadas da medula óssea (células estromais BMSC-Luc/eGFP) como anteriormente descrito por Bergwerf et al. 2, 5.
  2. Dois dias antes de marcação celular, as células BMSC-Luc/eGFP em placas a uma densidade de 8 x 10 células por 5 T75 frasco de cultura em meio de expansão 15 ml completo (CEM) suplementado com 1 ug / ml Puromycine.
  3. Permitir que as células a crescer durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  4. Adicionar 5 x 10 6 Glacial azul micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (GB MPIO) por ml de meio de cultura para a cultura de células em crescimento (total: 75 x 10 6 partículas por meio de cultura 15 ml em um frasco de cultura T75).
  5. Incubar durante 16 horas para permitir a captação de partículas através de endocitose.
  6. Lavar as partículas restantese permitir que as células crescer durante uma hora adicional 24 para obter uma distribuição de células de confluência e homogénea da MPIO GB.
  7. Validate captação de partículas visualmente usando microscopia de fluorescência através da contagem do rácio de EGFP + e MPIO GB + de células para a quantidade total de EGFP + de células.
  8. Lavar as células GB MPIO-rotulados BMSC-Luc/eGFP duas vezes com 10 ml de PBS e as células de colheita sequência de tripsina-EDTA tratamento (5 ml por frasco de cultura T75, durante 5 minutos).
  9. Lave as células colhidas e ressuspender em concentração final de 133 x 10 6 células / ml em PBS.
  10. Manter as células em gelo até ao transplante.

2. Implantação de células no SNC de Ratos

  1. Anestesiar ratinhos por uma injecção intraperitoneal de uma cetamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) mistura.
  2. Aguarde 5 minutos para permitir que os ratos para adormecer.
  3. Raspar a cabeça de rato para permitir manipulações estéreis.
  4. Posicione o mouse em um quadro estereotáxico.
  5. Desinfectares aa pele e os olhos molhado dos ratinhos para evitar a desidratação.
  6. Fazer uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio, e perfurar um orifício no crânio utilizando uma broca dental rebarba nas coordenadas dada: 2 mm posterior e 2 mm lateral à bregma.
  7. Vórtice da suspensão de células de forma breve e aspirar a suspensão de células na seringa.
  8. Coloque a agulha da seringa, a uma profundidade de 2,5 mm sob a dura-máter e permitir que o equilíbrio de pressão durante 1 minuto.
  9. Injectar uma suspensão de células 3 ul (4 x 10 5 células) a uma profundidade de 2 mm sob a dura-máter e com uma velocidade de 0,70 ul / min utilizando uma bomba de injecção de micro-automatizado.
  10. Esperar por um período adicional de 5 minutos, para evitar o refluxo da suspensão de células injectadas.
  11. Lentamente, retirar a agulha e desinfectar as fronteiras da pele antes da sutura da pele.
  12. Injectar 300 solução de NaCl a 0,9% uL por via subcutânea, a fim de evitar a desidratação, e colocar o rato sob uma lâmpada de aquecimento para recuperar da anestesia. Administrar post-operatório analgésico em conformidade com as normas institucionais.

3. Na bioluminescência in vivo

  1. Anestesiar os ratos por uma mistura de 3% de isoflurano e oxigénio.
  2. Coloque os ratos no Imager Photon e reduzir o nível de anestesia para 1,5%, isoflurano e oxigênio.
  3. Injectar 150 mg de D-luciferina por kg de peso corporal por via intravenosa.
  4. Adquirir imagem por 5 minutos, utilizando o software Vision Photo.
  5. Executar o processamento de imagem usando o software M3vision. Quantificar o sinal observado utilizando regiões de juro fixa.

4. Em Ressonância Magnética vivo

  1. Anestesiar os ratos com 3% de isoflurano em uma mistura de O 2: N 2 O (3:7).
  2. Colocar os ratinhos no limitador de um sistema horizontal MR 9.4T e reduzir a anestesia nível de 1% de isoflurano em uma mistura de O 2: N 2 O (3:7).
  3. Molhe os olhos dos camundongos para evitar desidrataçãoção, anexar uma sonda rectal de controlar a temperatura do corpo e monitorar a taxa de respiração pela colocação de um sensor de baixo da barriga do rato.
  4. Manter a taxa de respiração em 110 ± 10 respirações por minuto e manter a temperatura corporal constante dentro de uma estreita faixa de 37 ± 0,5 ° C.
  5. Coloque a bobina RF superfície sobre a parte superior da cabeça do rato e da posição do rato no meio do magneto.
  6. Adquirir um conjunto de 10 coronais ponderadas em T2 spin-eco (SE) imagens para obter informações anatômica específica e T2 * ponderadas gradiente eco (GE) imagens, a fim de estudar a migração de células-tronco com uma resolução no plano de 70 mM 2. Definir parâmetros de seqüência da seguinte forma: tempo de repetição (TR): 500 ms, tempo de eco (TE): 8 ms (seqüência GE) e tempo de repetição (TR): 4200 ms, tempo de eco (TE): 12,16 ms (SE seqüência); campo de visão (FOV): 18x18 mm 2, matriz: 256x256, 1 fatia de espessura mm e 1 fatia de separação mm (Paravision software 5.1).
  7. Realizar o processamento de dadosusando software Amira 4,0.

5. Post Mortem Histologia

  1. Anestesiar os ratos muito profundamente por inalação de um oxigénio isofluorano (4%), (0,5 L / min) e azoto (1 l / min) a mistura durante 2 minutos. Sacrifício dos camundongos por deslocamento cervical.
  2. Remover o cérebro do rato a partir do crânio e fixar o tecido cerebral em paraformaldeído a 4% em PBS durante 2 horas.
  3. Desidratar o tecido do cérebro, colocando o cérebro, posteriormente, em diferentes gradientes de sacarose: 2 h em sacarose a 5% em PBS, 2 horas em 10% de sacarose em PBS, durante a noite em sacarose a 20% em PBS.
  4. Congelar o tecido do cérebro utilizando azoto líquido e armazenar o tecido à temperatura de -80 ° C até seccionamento.
  5. Seção tecido do cérebro em 10 mM de espessura, utilizando um criostato.
  6. Tela unstained criossecções para a fluorescência azul a partir das partículas GB MPIO e fluorescência verde a partir das células que expressam EGFP usando um microscópio de fluorescência.
  7. Tela imaculada criosecções paraverde / vermelho fluorescência de fundo a partir de células inflamatórias.
  8. Realizar colorações mais imuno-histoquímica e imunofluorescência para identificar populações de células endógenas (por exemplo, a microglia, astrócitos, células T, ...) que interagem com enxertos celulares.

6. Os resultados representativos

Nós aqui apresentadas visualmente uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal sucesso da luciferase / eGFP expressar-populações (caule) de células no sistema nervoso central de camundongos. Na primeira, os descritos GB MPIO resultados de rotulagem procedimento em rotulagem altamente eficiente de células BMSC-Luc/eGFP, que podem facilmente ser validados utilizando microscopia de fluorescência (Figura 2A). Em seguida, mediante enxerto de GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP no SNC de ratinhos, a sobrevivência do enxerto celular pode ser monitorizada por in vivo BLI com base na actividade da luciferase (Figura 2B). Além disso, a localização exacta das células enxertadas pode ser monitorizada por in vivo (Figura 2C). Finalmente, a análise histológica permite a validação dos resultados obtidos por BLI e RM. Sobrevivência estável foi confirmada por uma expressão eGFP estável no tempo (Figura 2D). Para isso, colocalização de EGFP-expressando células com azul fluorescente MPIO permite a determinação exacta da localização e sobrevivência das células transplantadas. Além disso, este rotulagem dupla fluorescente das células-tronco reduz a possibilidade de observar resultados falsos positivos baseados em fluorescência de fundo criado por células inflamatórias 5.

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Figura 1. Visão geral da seqüência de manipulação

  1. Marcação celular: BMSC-Luc/eGFP são rotulados com 5 x 10 6 partículas GB MPIO por ml de meio de cultura. Após 16 hr de incubação e um período de repouso seguinte de 24 horas, as células são colhidas paraimplante intracerebral.
  2. Implante de células: GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP são enxertados no cérebro do rato nas coordenadas seguinte: bregma -2 mm, 2 mm direita da linha média e 2 mm sob dura.
  3. In vivo BLI: administração intravenosa de 150 mg D-luciferin/kg peso corporal, a luz gerada foi adquirida durante 5 minutos usando o Imager Photon.
  4. In vivo RM: Um conjunto de 10 coronais ponderadas em T2 spin-eco (SE) imagens e T2 * ponderadas gradiente eco (GE) imagens com uma resolução no plano de 70 mM 2 foram adquiridos. Parâmetros de sequência foram as seguintes: tempo de repetição (TR): 500 ms, tempo de eco (TE): 8 ms (sequência GE) e tempo de repetição (TR): 4200 ms, tempo de eco (TE): 12,16 ms (sequência SE); campo de visão (FOV): 18x18 mm 2, matriz: 256x256, 1 fatia de espessura mm e 1 fatia de separação mm.
  5. Post-mortem histologia: cryosection espessura 10μm foram selecionados para eGFP expressar e azul fluorescente etiquetado BMSC ucantar um microscópio de fluorescência.

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Figura 2. Imagem Multimodal de enxertos de células-tronco

  1. Microscopia de imunofluorescência direta da Glacial azul (GB) MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP.
  2. In vivo BLI de camundongos injetados com 4x10 5 GB MPIO rotulado células BMSC-Luc/eGFP na semana 1 e semana 2 após a implantação. A análise estatística dos sinais detectados BLI na semana 1 e semana 2 pós-implantação. Os dados são expressos como o número médio de fotões por segundo por esterradiano por centímetro quadrado (pH / s / SR / cm 2) a partir de um período de tempo 5 minutos + / - erro padrão calculados a partir de uma região de interesse fixa em ratinhos apresentando um sinal claro BLI no local da injecção.
  3. Coronal bidimensional de ressonância magnética GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP (painel da esquerda: (i) ponderação T2 spin echo e (ii) T2 *-weighted imagem eco gradiente) e sem rótulo BMSC-LUC / eGFP (painel da direita: (iii) ponderação T2 spin echo e (vi) T2 *-weighted imagem eco gradiente) enxertos em cérebro de camundongo.
  4. A análise histológica do MPIO GB rotulado implantes BMSC-Luc/eGFP na semana 2 pós-implantação. (I) a análise de imunofluorescência directa para a localização de EGFP-expressar e MPIO GB enxertos BMSC-Luc/eGFP rotulados. (Ii) detalhe ampliação elevada de (i). (Iii) coloração imunofluorescente para o antigénio GFAP, indicando o desenvolvimento de tecido cicatricial no astrocítica circundante de GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP. (Vi) coloração de imunofluorescência para Iba-1 antígeno, indicando a invasão e ao redor da GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP por microglia.

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Discussão

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Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para a combinação de três modalidades de imagem complementares (BLI, ressonância magnética e histologia) para a caracterização detalhada dos implantes celulares no sistema nervoso central de camundongos imunes competentes. Uma combinação de rotulagem de gene repórter de células, com base na modificação genética com os genes repórter luciferase do pirilampo e EGFP, e uma célula de rotulagem directa com a GB MPIO, conduz a uma avaliação precisa de enxertos de células...

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Divulgações

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Os autores declaram nenhum conflito de interesse.

Agradecimentos

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O trabalho do autor foi apoiado por bolsa de investigação-ID BOF 2006 da Universidade de Antuérpia (concedido a PPO e AVdL), pela bolsa de investigação G.0136.11 e G.0130.11 (concedido a AVdL, ZB e PPO) e 1.5.021.09. N.00 (concedido a PPO) do Fundo de Pesquisa Científica-Flanders (FWO-Vlaanderen, Bélgica), pela SBO bolsa de investigação IWT-60838: BRAINSTIM do Instituto Flamengo para a Ciência e Tecnologia (concedida a ZB e AVDL), em parte de uma pesquisa Methusalem concessão do governo flamengo (concedido a ZB), em parte, pela EC-FP6-NoE DIMI (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) , e pelo Inter Universidade atração poloneses IUAP-NIMI-P6/38 (concedido a AVDL). Nathalie De Vocht tem um PhD bolsa de estudo a partir do FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts é um pós-doutorado da FWO-Vlaanderen.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
IMDM Lonza BE12-722F Componente do CEM meio de crescimento celular
Soro fetal de bovino Gibco 10270-106 Componente do CEM meio de crescimento celular
De soro de cavalo Gibco 1605-122 Componente do CEM meio de crescimento celular
Penicilina-estreptomicina Gibco 15140 Componente do CEM meio de crescimento celular
Fungizone Gibco 15290-018 Componente do CEM meio de crescimento celular
PBS Gibco 14190
Puromycine Invivogen formiga-pr-1
tripsina Gibco 25300
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833
D-luciferina Promega E1601
De cetamina (Ketalar) Pfizer
Xilazina (Rompun) Bayer Os cuidados de saúde
Isoflurano Isoflo 05260-05
0,9% de solução de NaCl Baxter
paraformaldeído Merck 1.04005.1000
sacarose Applichem A1125
Micro-injecção de bomba KD científica KDS100
Photon imager Biospace Lab
9.4T scanner de MR Bruker BioSpin Biospec 94/20 USR
BX51 microscópio Olimpo BX51
Mycrom HM criostato Prosan HM525
seringa Hamilton 7635-01
Agulha de calibre 30 Hamilton 7762-03
Foto Visão software Biospace Lab
M3vision software Biospace Lab
Paravision software 5,1 Bruker BioSpin
Amira 4,0 software Imagem Visage

Referências

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