De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

Summary

Imagem tecido embrionário em tempo real, é um desafio durante longos períodos de tempo. Aqui nós apresentamos um ensaio para o monitoramento das alterações celulares e sub-celular na medula espinhal pinto por longos períodos com resolução espacial e temporal. Esta técnica pode ser adaptado para outras regiões do sistema nervoso e embrião em desenvolvimento.

Abstract

O cordão espinal embrionária consiste de ciclismo células progenitoras neurais que dão origem a uma grande percentagem das células neuronais e gliais do sistema nervoso central (SNC). Embora muito se sabe sobre os mecanismos moleculares que padrão a medula espinhal e provocar a diferenciação neuronal ^{1, 2,} falta-nos um profundo entendimento desses eventos iniciais ao nível do comportamento das células. É, portanto, crucial para estudar o comportamento de células progenitoras neurais em tempo real, como se submetem a neurogênese.

No passado, imagem em tempo real do tecido embrionário inicial tem sido limitada pela célula / tecido viabilidade em cultura, assim como os efeitos fototóxicas de imagem fluorescente. Apresentamos aqui um ensaio de novo para a imagiologia de tecido, tais por longos períodos de tempo, utilizando um novo protocolo de cultura ex vivo fatia e de campo largo microscopia de fluorescência (Fig. 1). Essa abordagem alcança monitoramento de longo prazo de lapso de tempo de pinto embrionário scélulas do cordão pinal progenitoras com resolução espacial e temporal.

Este ensaio pode ser modificado para a imagem de uma gama de tecidos embrionários ^{3, 4} Para além da observação de comportamentos celulares e sub-celular, o desenvolvimento de novos e repórteres altamente sensíveis para a actividade do gene (por exemplo, sinalização Notch ⁵⁾ faz com que este ensaio uma ferramenta poderosa com a qual compreende como sinalização regula o comportamento celular durante o desenvolvimento embrionário.

Protocol

1. Preparação prato

1. Pratos utilizados para a cultura fatia são de vidro de fundo (com uma lamela como a base) (pratos WillCo). Estes são colocados sobre o tecido da lente em um prato de 6 centímetros de cultura de tecidos para manter o fundo de vidro limpo.
2. No dia antes da experiência, adicionar 2 ml 0,1% de solução de poli-L-lisina para o prato de vidro de fundo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que o poli-L-lisina revestir o fundo de vidro.
3. Remover a poli-L-lisina solução e lavar três vezes em água desionizada, e depois uma vez em etanol a 70%.
4. Deixar a secar durante a noite. Pratos podem também ser secos por aquecimento suave num microondas em baixa potência durante 30-45 segundos.

2. Eletroporação embrião

1. Incubar ovos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) estágio 10 (~ 36 horas) (ou fase desejada outro).
2. Antes de começar preparar as agulhas de vidro (utilizamos uma flamejante / Brown modelo P87 extrator microcapilar) e quebrar a ponta da needle utilizando um fórceps finos sob um microscópio de dissecação. A extremidade da agulha deve ser afiado o suficiente para perfurar o embrião, embora não sendo tão estreita que impede a injecção da solução de ADN.
3. Ovos de janela e eléctrodos lugar (5 milímetros de intervalo) em ambos os lados do embrião
4. Injectar DNA (~ 0,025-0,5 mg / ul em água desionizada colorido com uma pequena quantidade de verde rápido) para dentro do tubo neural.
5. Aplicar atual - 12-17 V três vezes, o comprimento do pulso de 50ms com 950 ms entre os pulsos.
6. Usamos baixas concentrações de DNA e tensões eletroporação baixos para alcançar expressão mosaico para que possamos seguir células individuais.
7. Cubra janela na casca do ovo com durex e verifique se ele está selado.
8. Permitir que os embriões para recuperar durante 3-4 horas ou durante a noite a 37 ° C.

3. Colágeno e Slice Preparação Meio de Cultura

1. Preparar a mistura de colágeno e meio de cultura fatia cerca de uma hora antes de fatiar.
2. Para 300 t uLipo colagénio 1 adicionar 100 uL de solução de ácido acético a 0,1% e 100 uL de 5 x meio L15. Vortex bem após cada adição. A solução deve virar amarelo.
3. Agora adicionar bicarbonato de sódio 15-20 ul de 7,5% e completamente vórtice. A solução deve tornar-se ligeiramente cor de rosa, eo volume de bicarbonato de sódio necessária para este pode diferir. Manter em gelo e fazer-se fresco a cada vez.
4. A 10 ml de meio neurobasal adicionar B-27 e suplemento Glutamax, para uma concentração de 1 x 10 solução final e gentamicina uL.
5. Médio lugar numa incubadora a 37 ° C tamponada com 5% de CO _2. Deixar a parte superior do recipiente para permitir que ele solto para equilibrar com a ₂ CO.

4. Cultura Slice

1. Remover embriões de ovos e lave em meio L15.
2. Colocar em um prato de cultura de tecidos com uma camada de Sylgard na parte inferior e fixá-los para fora através das vizinhas membranas extra-embrionárias de modo que eles são esticada.
3. Usando um microfoneroknife, embrião fatia mais reto possível através da região de interesse. Para medula espinal, as fatias deve estar entre 1-2 sómitos de espessura. Deixe fatias ligados ao embrião, enquanto você corta outros embriões que você não perdê-los.
4. Prepara-se uma ponta 200 uL micropipeta cortando ~ 1 mm da ponta e anexando presente a um p2 ou p10. Esta ponta vai ser usado para transferir as fatias da medula espinal ao prato fundo de vidro. Uma dica 10 ul não é ampla o suficiente para pegar fatias.
5. Revestir o interior da ponta com colagénio por pipetagem de 1 uL de colagénio mistura preparada anteriormente. Deixe por 1-2 minutos e depois lave com L15 médio. Isto impedirá que o tecido de furar para o interior da ponta.
6. Destaque fatia do embrião usando um microlanceta e retire do prato usando um p2 ou p10 equipado com uma ponta de 200 ul e definido para 1 ml. Tente tomar-se como meio mínimo possível.
7. Agitar a mistura de colagénio e gota 5-8 uL desta para o prato de poli-L-lisina revestido.
8. Immediadamente colocar fatia embrião em colágeno e posição no lugar com um par de pinças finas. Fatias devem ser posicionado de modo que o lado a ser trabalhada é nivelada com a lamela. O tecido deve aderir o revestimento de poli-L-lisina sobre a lamela.
9. Repita este procedimento até ter várias fatias na lamela. Em geral podemos colocar 6-9 fatias em um prato.
10. Uma vez que todas as fatias estão no lugar, cobrir o prato e permitir que o colagénio para definir durante 20 minutos. Alguns dos primeiros colocados do colágeno pode já ter começado a secar. Para evitar este adicionar uma pequena quantidade de L15 a estes antes de cobertura.
11. Uma vez ajustado, cuidadosamente adicionar meio de cultura 2ml fatia que tem sido equilibrada em CO2 a _5% a 37 ° C durante pelo menos uma hora. Cuidados devem ser tomados para não desalojar o colágeno da lamela.
12. Colocar em um 37 ° / 5% de CO ₂ incubadora e permitir que as fatias para recuperar durante pelo menos 3 horas antes de imagem. Se não houver umidade prato, colocar em uma sagacidade caixa de acrílicoha pouco de papel de filtro humedecido em um canto.

5. Embrião Fatias de imagem

1. Nós usamos um Core DeltaVision microscópio de campo amplo equipado com uma câmara EstaçãoMeteorológica ambiental para fatias de imagem. A câmara é constantemente mantido a 37 ° C, com um aparelho de perfusão CO ₂ para manter a fase microscópio em 5% de CO ₂ / ar de 95%.
2. Imagens é normalmente levada a cabo usando um 40 x / 1,30 NA lente de imersão em óleo e as imagens são capturadas com um HQ2 CoolSnap arrefecida câmara CCD.
3. Z-seções são capturadas a cada 1,5 mM por 45 mM de tecido. Tempo de exposição deve ser mantida tão baixa quanto possível. Nós normalmente expor para 5-50 ms para cada Z-seção. As imagens são capturadas a cada 7 minutos e até 9 fatias pode ser visitada usando ponto preciso do sistema DeltaVision de visitar função.

6. Os resultados representativos

Um exemplo de seqüência de lapso de tempo de uma célula da medula espinhal progenitor émostrado na fig. 2a e filme correspondente 1. Imagem foi iniciado em uma fatia da medula espinhal de um dois dias de idade embrião (HH estádio 12). Esta célula foi transfectada com um construto expressando GFP αTubulin. Durante esta fase inicial, as células progenitoras neurais sofrer divisões predominantemente progenitora progenitoras de modo durante o qual as células se dividem para gerar duas células progenitoras mais ciclismo. Fig. Filme 2b e correspondente 2 mostra uma célula transfectada com GFP-GPI (GPI ancorada GFP), a marcação da membrana celular. Esta célula sofre uma divisão durante o qual o processo se divide em dois basal e é igualmente herdado pelas células filhas.

Figura 1. Protocolo Slice para cultura de lapso de tempo de imagem.

Figura 2. B célulaehavior durante o desenvolvimento normal de medula espinhal. (a) quadros selecionados de Movie 1. Celular expressando GFP-tubulina divide com um plano de clivagem que é perpendicular à superfície apical (2 h 20 min), gerando duas células filhas que dividem mais uma vez (24 h 23 min e 25 h 54 min). (B) os quadros selecionados do filme 2. Células transfectadas com GFP-GPI sofre a divisão celular durante o qual o processo é dividido basal (setas brancas) e igualmente herdado pelas células filhas.

Filme 1. Clique aqui para ver filme .

Filme 2. Clique aqui para ver filme .

Discussion

Apresentamos aqui um ensaio de imagem romance lapso de tempo para monitorar o comportamento das células em cultura de frango fatia embrionário. Este ensaio permite imagens de alta resolução de tecido vivo por até 70 horas, embora os prazos entre 24-48 horas são mais fáceis de capturar. A utilização de uma objectiva de óleo elevado NA e intervalos de tempo relativamente curtos entre os pontos de aquisição de imagem permite em alta resolução, bem como nos permitindo controlar o comportamento das células, que muitas vezes ocorre rapidamente, e pode ser facilmente perdido durante imagiologia lapso de tempo convencional utilizando confocal microscopia.

A principal vantagem deste ensaio é a capacidade de células de imagem ao longo de períodos longos de tempo. A utilização de gama-campo ^{6 em} vez de laser confocal ⁷ microscopia é crítico para este. A microscopia confocal tem tradicionalmente oferecia várias vantagens sobre gama microscopia de campo, incluindo a capacidade de tomar secções ópticas e eliminar de informações diretamente foco ^{7, mas o uso de um furo de pino conduz a uma perda de luz para o detector de 8, excluindo uma quantidade significativa de informação, e que necessitam de tempos de exposição mais longos. Gama microscopia de campo, por outro lado, utiliza iluminação de campo completo e todos passagem da luz através do objectivo é enviado para o detector. Isto acoplado com uma elevada eficiência quântica arrefecida com dispositivo de acoplamento de câmara (CCD) assegura de imagem com uma alta relação sinal-ruído em comparação com microscopia confocal 9, com tempos de exposição muito rápidos. Em nossa aplicação, devemos imagem por longos períodos, registro pilhas 3D e, finalmente, resolver pequenos de difração de quase-estruturas limitadas. Embora microscopia confocal impede fora-de-foco de luz sempre de alcançar o detector e assim reduz significativamente fundo em espessura, densamente-rotulados amostras 7, 8, ele só atinge uma relação sinal-ruído utilizável com a entrada de luz muito maior do que largo microscopia de campo 10. Para sparsel muito sensível à luzamostras y-rotulados como nossos eletroporados fatias de medula espinhal, portanto, ampla microscopia de campo tem um desempenho melhor do que a microscopia confocal. Quando combinado com restauração de imagem por deconvolução, que remove as informações de foco e melhora o contraste, campo-larga é então particularmente bom para a detecção de objetos pequenos, dim 11. Apesar de não ser apropriado para cada experimento tissular, esta abordagem tem sido muito eficaz para a nossa aplicação de células vivas de imagem.}

A escolha de proteína fluorescente é um factor importante que pode influenciar a sobrevivência celular. Descobrimos que os melhores resultados são obtidos a partir de construções que utilizam a proteína fluorescente verde (GFP) ¹² como um marcador. Estamos neste momento a avaliar uma série de proteínas fluorescentes vermelhas que podem ser efetivamente utilizados em combinação com GFP para dual channel lapsos de tempo. Há uma variedade de tais proteínas disponíveis ^13. Embora muitas proteínas são estáveis ​​como fusões com uma proteína fluorescente, Algumas proteínas podem ser processado por fusão instável, resultando na viabilidade celular reduzida. Em tais casos, a utilização de construções que contêm um local de entrada interna ribossoma (IRES) é útil para separar a proteína de interesse a partir da proteína fluorescente.

Obtenção de imagens de fatias de medula espinhal, cuidados devem ser tomados para minimizar a exposição à luz fluorescente. As oculares do microscópio deve ser usado somente com luz transmitida (brightfield) para localizar e posição fatias. Imagens fluorescentes devem sempre ser adquiridos utilizando o software microscópio usando tempos de exposição mínimos. Estes devem ser mantidos na gama de 5-50 ms eo uso de filtros de densidade neutra deve ser experimentado. Embora os tempos de exposição mais longos podem, inicialmente, produzir imagens claras, os efeitos fototóxicas de exposição à luz fluorescente pode conduzir à morte celular. Os primeiros 5-10 iM de tecido que está mais próxima da lamela não deve ser trabalhada como esta região contém tecido que pode ter sido danificado durantecorte.

Embora os exemplos aqui apresentados são de embriões electroporado em HH fase 10 e fotografada 6-7 horas mais tarde, este método pode ser usado para os embriões até HH fase 18. Em fases posteriores, o tecido da medula espinal é muito maior e assim é difícil de cortar com a mão. Nestes casos, a incorporação dos embriões em baixo ponto de fusão de agarose e corte com um vibratome pode produzir melhores resultados. Mesmo que apresentam este ensaio como um método para células de imagem na medula espinhal em desenvolvimento, esta abordagem também tem sido modificado para outros tecidos embrionários de imagem, incluindo o placódios sensorial ^3.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
WillCo Dish	WillCo Wells	GWst-3522
poli-L-lisina	Sigma	P8970	0,1% em Tris
Borosilicato capilares de vidro	Harvard Instruments	GC100-10	Diâmetro exterior 1,0 milímetros, Diâmetro interno 0,58 milímetros
Eléctrodos (Genetrodes, em ovo, em forma de L	BTX	10-001850-01	5 milímetros ouro plaqueada
ECM 830 quadrado gerador de pulso	BTX	45-0002	no electroopration in ovo
Verde rápido	Sigma	F7258
O colágeno tipo I rato	Sigma	C3857
L-15 médio (em pó)	Sigma		2,76 g / L em água destilada para solução de 5x
O bicarbonato de sódio	Sigma	S8761	Solução 7,5%
Médio Neurobasal	Invitrogen	12348-017	sem vermelho de fenol
Glutamax	Invitrogen	A1286001	Solução 100x
B-27 suplemento	Invitrogen	17504-044
Gentamicina	Invitrogen	15710049	10 mg / ml
L15 médio (líquido 1x)	Invitrogen	11415-049
Microlanceta	Altomed	A10102	15 graus de inclinação
Pinos de aço inoxidável sem cabeça	Watkins e Doncaster	E6871	Tamanho A1
Sylgard elastômero 184	VWR	634165S
DeltaVision sistema de microscópio núcleo	Precisão Aplicada
Coolsnap HQ2 câmera CCD	Photometrics