Este artigo vai descrever o procedimento para a síntese de uma membrana Nafion hidrofobicamente modificado imobilização de enzimas e como para imobilizar proteínas e / ou enzimas no interior da membrana e testar a sua actividade específica.
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Artigo de método
Nafion-Sal modificado hidrofóbico para imobilização de enzimas e Estabilização
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante a última década, tem havido uma riqueza de aplicação para as enzimas imobilizadas e estabilizadas incluindo biocatálise, biossensores, e células de biocombustível. 1-3 Em aplicações mais bioelectrochemical, enzimas ou organelas são imobilizados sobre uma superfície do eléctrodo com a utilização de algum tipo de polímero de matriz. Este andaime polímero deve manter as enzimas estável e permitir a difusão fácil de moléculas e iões dentro e para fora da matriz. A maioria dos polímeros utilizados para este tipo de imobilização são baseados em poliaminas ou poliálcoois - polímeros que imitam o ambiente natural das enzimas que eles encapsular e estabilizar a enzima através de hidrogénio ou ligações iónicas. Outro método para a estabilização de enzimas envolve o uso de micelas, que contêm regiões hidrofóbicas que podem encapsular e estabilizar as enzimas 4,5. Em particular, o grupo Minteer desenvolveu um polímero baseado em micelar Nafion comercialmente disponível. 6,7 Nafionem si é um polímero micelar que permite a difusão de canal-assistida de protões e de outros catiões pequenas, mas as micelas e os canais são extremamente pequeno e que o polímero é muito ácida, devido às cadeias sulfónicos lado ácido, o que é desfavorável para a imobilização de enzimas. No entanto, quando Nafion é misturado com um excesso de hidrofóbicos sais de amónio de alquilo tais como brometo de tetrabutilamónio (TBAB), os catiões de amónio quaternário substituir os protões e tornar-se os contra-iões para os grupos sulfonato sobre as cadeias laterais de polímero (Figura 1). Isto resulta em maiores micelas e canais dentro do polímero que permitem a difusão de grandes substratos e iões que são necessários para a função enzimática, tais como dinucleótido adenina nicotinamida (NAD). Este modificado Nafion polímero tem sido usado para imobilizar muitos tipos diferentes de enzimas, bem como as mitocôndrias para uso em biossensores e células de biocombustível. 8-12 Este documento descreve um novo processo para fazer este microfoneEllar polímero membrana imobilização de enzimas que podem estabilizar as enzimas. A síntese da membrana micelar enzima imobilização, o procedimento para a imobilização de enzimas dentro da membrana, e os ensaios para estudar a actividade enzimática específica da enzima imobilizada são detalhados abaixo.
Protocolo
1. Modificação do Nafion com sais de amónio quaternário
- Agitar uma garrafa de suspensão Nafion 5% w / v vigorosamente durante aprox. 30 segundos para assegurar que Nafion é suspenso uniformemente na solução.
- Pipetar fora 2 mL da Nafion agora re-suspenso em um frasco de vidro (volume frasco pode conter de 2,5 mL a 10 mL).
- Medir um excesso de 3 vezes molar (em relação aos grupos de ácido sulfónico no polímero Nafion) do sal de amónio de alquilo brometo de (massas adequadas são mostrados na Tabela 1) e adicionar este ao frasco contendo o 2 mL de Nafion.
- Vortex do frasco a 1500 rpm por 10-15 minutos.
- Des....
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Discussão
No processo descrito, os sais de tetra-alquil amónio são utilizados para modificar Nafion comercial para criar polímeros micelares que podem ser usados para imobilizar e estabilizar as enzimas. Os ensaios descritos no procedimento revelam que o polímero pode ser usado para imobilizar uma grande variedade de enzimas com uma elevada retenção de actividade. Se a enzima de interesse tem uma actividade muito baixa ou é impuro, uma concentração mais elevada pode ser necessária e não deve afectar o processo de imobilização, .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores agradecem o Escritório de Pesquisa Naval, United Soybean Board, e Fundação Nacional de Ciência para o financiamento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Brometo de tetra sais alquilamónio | Sigma-Aldrich | n / a | |
| Álcool desidrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Pirofosfato de sódio | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Fenazina metossulfato (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6 Dichloroindophenol-(DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| Ácido 4-hidroxibenzóico | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| A azida de sódio | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipirina | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| UV / Vis Espectrofotômetro | Thermo | Evolução Bio 260 ou Spectronic Genesys 20 | |
| Vortex Genie | |||
| Balança analítica |
Referências
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrol....
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Reimpressões e permissões
