Summary
이 문서 hydrophobically 수정된 Nafion의 효소 고정 막 방법과 멤브레인 내에 단백질 및 / 또는 효소를 고정하고 구체적인 활동을 테스트하는 방법을 합성을위한 절차를 설명합니다.
Abstract
지난 10 년 동안, biocatalysis, biosensors, 그리고 생물 연료 전지를 포함하여 고정화 및 안정화 효소에 대한 응용 프로그램의 풍부한이있었습니다. 가장 bioelectrochemical 애플 리케이션에서 1-3, 효소 또는 organelles은 어떤 유형의를 이용하여 전극 표면에 고정화되어 폴리머 매트릭스. 이 폴리머 비계는 효소 안정 유지하고와 모체의 밖으로 분자 및 이온의 손쉬운 보급을 위해 허용해야합니다. 고정 이러한 유형에 사용되는 대부분의 고분자는 polyamines 또는 polyalcohols을 기반으로하는 - 그들이 수소 또는 이온 결합을 통해 효소를 캡슐하고 안정화하는 효소의 자연 환경을 모방 고분자. 효소를 안정화하는 또 다른 방법은 효소를 캡슐과 안정 수있는 소수성 영역을 포함하는 micelles의 사용을 포함한다. 특히 4,5, Minteer 그룹은 상용 Nafion에 근거 micellar 폴리머를 개발하였습니다. 6,7 Nafion은자체는 양자와 기타 작은 양이온의 채널을 이용한 확산을 허용 micellar 고분자이지만, micelles 및 채널은 매우 소규모이며 폴리머 효소 고정을위한 불리 술폰산 사이드 체인으로 인해 매우 산성이다. 그러나, Nafion은 같은 tetrabutylammonium의 브로마이드 (TBAB)와 같은 소수성 알킬 암모늄 소금의 과잉과 함께 혼합되면 제사기 암모늄 양이온은 양자를 교체하고 폴리머 사이드 체인 (그림 1)에서 산염 그룹 카운터 이온이된다. 이러한 니코틴 아데닌 dinucleotide (NAD)와 같은 효소 기능을 위해 필요한 대형 기판과 이온의 확산을 허용 고분자 내에서 큰 micelles 및 채널에있는이 발생합니다. 이 수정된 Nafion 폴리머는 biosensors과 생물 연료 전지에 사용하기 위해 여러 효소의 종류뿐만 아니라, mitochondria를 고정하는 데 사용되었습니다. 8-12 본 논문이 마이크를 만들기위한 새로운 절차를 설명합니다효소의 안정화 수 ellar 폴리머 효소 고정 막. micellar 효소 고정 막, 멤브레인 내에 효소를 immobilizing 절차 및 고정화 효소의 효소 구체적인 활동을 유학 assays의 합성은 아래 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
1. 제사기 암모늄 소금과 Nafion의 변경
- 약 강력 5퍼센트 W / V Nafion 서스펜션의 병을 흔들어. 그 Nafion를 보장 30 초간 용액에 균일하게 정지됩니다.
- 유리관 (유리병 볼륨 2.5 ML에서 10 ML에 포함할 수있는)으로 지금은 다시 정지 Nafion 2 ML을 피펫.
- 3 배 어금니 초과 (Nafion 폴리머에 sulfonic 산 그룹에 상대적인) 알킬 암모늄 브로마이드 소금 (적절한 질량은 표 1에 표시된)의 측정과 Nafion의 2 ML이 들어있는 유리병에 이것을 추가합니다.
- 10-15분위한 1,500 RPM의 소용돌이 병을.
- 약 측정 플라스틱 무게 트레이에 점성 용액을 부어. 3인치 X 3, 무게 트레이에 약병에서 잔여 솔루션을 전송하는 피펫을 사용합니다.
- 용매는 무게 트레이의 하단 (FI에 노란색 / 갈색, 투명 필름을두고, 무게는 배 밖으로 증발하도록 허용gure 2). 용매 증발의 비율은 증발하여 모든 용매에 대한 더 이상의 6 시간 소요 있도록해야합니다. 용매 증발 너무 빠른 경우, 흰색, 피각질의 재료는 폴리머의 micellar 구조가 파괴되었음을 나타내는 투명 필름 대신에 형성되며,이 절차를 다시 시작해야합니다. 용매 증발이 너무 느린 경우에는 증발의 너무 느린 일반적으로 볼품없는, 오렌지 젤로 연결하고 절차를 다시 시작해야하기 때문에, 드 가습기가 필요할 수 있습니다. 37 ° C. - 용매 증발에 대한 일반적인 온도 범위는 20입니다 건조를위한 실제 조건 방에 상대 습도와 온도의 함수지만, 그것은 중요 겔 형성하도록하기 위해서 건조 마이셀 구조를 유지할 느리게되고,하지만 너무 느려니다.
- 채우기 18M Ωcm 드 이온화된 물 (물 10-20 ML), 커버와 함께 보트를 저울질하고, 초과 알킬 암모늄 브로마이드 소금과 HBR를 제거하는 12~24시간 동안 약물 사용하실 수 있습니다.
- 폴리머는이 시점에서 완전히 건조까지 밝혀낸 앉을 수있는 무게 트레이를 허용, 폴리머는 분명하고 다소 부서지기 쉬운 플라스틱 필름이어야합니다. 공기가 매우 습기가있다면 다시, 드 가습기는 적시에 증발을 완료하는 데 필요할 수 있습니다.
- 주걱을 사용하여 조심스럽게 무게 트레이에서 말린 필름을 제거하고 깨끗한 유리관에 그 파일을 전송합니다.
- 에탄올 2 ML 그리고 3 세라믹 혼합 비즈, 4 시간 동안 와동을 추가 또는 폴리머 필름이 완전히 다시 정지 때까지.
2. 활동 Assays위한 TBAB-수정된 Nafion에 효소의 고정
- 건조 효소의 경우 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 효소 중 1-10 밀리그램을 무게, 그리고 1-10 MG / ML 효소 솔루션을 만드는 데 100 밀리미터 산도 7 인산염 완충액 1 ML을 추가합니다. 정R 용액에 효소는 단백질의 양을 결정하는 bicinchoninic 산성 (BCA) 검정 13 사용하고 1-10 밀리그램 / ML로 단백질 농도를 가지고 100 MM 인산 버퍼의 적절한 금액을 추가합니다. 1-10 MG / ML은 일반적으로 1-50 nanomoles / ML에 해당합니다.
- 1 MG / ML 효소 용액 120 μL, 10 초 동안 60 알킬 암모늄 - 수정된 Nafion 솔루션 μL, 그리고 소용돌이를 추가합니다. (이 혼합물은 복제 다수에 확장할 수 있습니다. 2시 1분에서 효소 - 투 - 폴리머 용액 비율을 유지.)
- 피펫 60 세 별도 1cm 2 cuvettes의 하단에 효소 / 폴리머 솔루션의 μL, 그리고 하룻밤 건조하실 수 있습니다.
3. 고정화 NAD 의존 탈수소 효소의 분석
- cuvette에 50 밀리미터 나트륨 pyrophosphate (산도 8.8) 1.3 ML, 15 MM NAD (신선한)의 1.5 ML, 그리고 0.1 ML 물을 추가합니다.
- UV / VIS 분광 광도계 (예 : ThermoScientific Evolut에 cuvette를 배치이온 260 바이오 및 써모 Spectronic Genesys 20) 340 nm의 파장의 설정.
- 분광계를 제로, 그리고 0.1 ML의 에탄올을 추가합니다. 부드럽게 5 번 아래로 솔루션을 pipetting 및하여 시약을 섞는다. 빈 경우, 별도의 물을 0.1 ML 대신 에탄올의 0.1 ML을 사용합니다.
- 시약이 후 cuvette 20 분에 추가된 후 5 분 340 nm의 흡광도에서를 기록합니다. 활동 계산에 사용할 수 경사면을 얻기 위해 두 개의 데이터 포인트를 잡아.
4. 고정화 PQQ 종속 Dehydrogenases의 분석
- cuvette로 인산 나트륨 1.5 ML (산도 7.3), 600 μm의 PMS 200 μL를 추가합니다.
- 600 nm의 파장의 설정 UV / VIS 분광 광도계의 cuvette를 삽입 후 분광계를 제로.
- 700 μL DCIP의 100 μL와 관심 기판 (에탄올, 아세트 알데히드, 글리세린, 포도당, 또는 glyceraldehyde) 200 μL를 추가하고 부드럽게 solut를 pipetting하여 시약을 섞어이온 위 아래로 5 번. 빈 들어, 200 물의 μL 대신 관심 기판을 사용합니다.
- 시약이 후 cuvette 20 분에 추가된 후 5 분 600 nm의 흡광도에서를 기록합니다.
5. 고정화 포도당 산화 효소의 분석
- cuvette에 0.2 M P-hydroxybenzoic 산, 0.02 % (W / V) 나트륨 azide, 128 U 퍼옥시데이즈, 4 aminoantipyrine 0.3 MM, 1 M 인산 칼륨, 50 MM 포도당을 포함하는 솔루션의 2.0 ML을 추가합니다. 5 번 아래로 pipetting 및하여 솔루션을 섞는다.
- 510 nm의 파장의에 VIS / UV 분광 광도계 세트에 cuvette를 놓습니다.
- 시약은시 20 분 cuvette하고 다시에 추가된 후 5 분 510 nm의 흡광도에서를 기록합니다.
6. 대표 결과
수정된 Nafion 중합체의 micellar 구조는 원래 소금 / 고분자 공동 casted 필름도 FAS 건조에 의해 중단될 수 있습니다티. 그림 2 제대로 투명하게, 밝은 갈색 필름으로 인한 건조되었습니다 소금 / 폴리머 혼합물을 보여줍니다. 마르면 너무 빨리 건조 과정 micellar 구조를 파괴할 수있다는 사실에 의한 고분자의 불투명, 백색 박편을 초래할 수있는 영화.
수정된 Nafion 고분자와 효소가 혼합 및 cuvette의 하단에 공동 캐스팅되고 나면 효소 활동 assays는 폴리머 필름 내에서 효소의 안정성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 테이블 두 탈수소 효소의 2-4 쇼 분석 결과 그리고 포도당 산화 효소는 각각 다양한 바뀌었 Nafion 필름으로 고정. 수정된 Nafion의 폴리머가 실제로 특정 효소 (superactivity 불리는)의 활동을 향상시킬 수 있다고 보여주는, 버퍼 용액에 효소 수와 고정화되는 효소의 높은 활동을합니다. 다른 효소는 고분자에 그들을 고정했을 때 그들의 구체적인 활동을 감소 전송 제한이 있습니다 (그의 기판) 상당히 큰 macromolecules 있습니다 즉 cellulases 및 amylases.
| 사용 제사기 암모늄 염 | 3 배 초과 |
| T3A (tetrapropylammonium 브로마이드) | 32.37 MG / ML |
| TBAB (tetrabutylammonium 브로마이드) | 39.19 MG / ML |
| TPAB (tetrapentylammonium 브로마이드) | 46.01 MG / ML |
| TEHA (triethylhexylammonium 브로마이드) | 32.37 MG / ML |
| TMHA (trimethylhexylammonium 브로마이드) | 27.25 MG / ML |
| TMOA (trimethyloctylammonium 브로마이드) | 30.66 MG / ML |
| TMDA (trimethyldecylammonium 브로마이드) | 34.07 MG / ML |
| TMDDA (trimethyldodecylammonium 브로마이드) | 37.48 MG / ML |
| TMTDA (trimethyltetradecylammonium 브로마이드) | |
| TMHDA (trimethylhexadecylammonium 브로마이드) | 44.31 MG / ML |
| TMODA (trimethyloctadecylammonium 브로마이드) | 47.71 MG / ML |
표 1. tetra-알킬 암모늄의 염분의 금액은 Nafion 폴리머 변형에 사용할.
| Nafion의 종류 | 효소 활동 (U / G) |
| 버퍼 (없음 폴리머) | 16.63 ± 8.11 |
| Nafion (un-mod.) | 9.25 ± 2.21 |
| TMTDA | 3.23 ± 2.92 |
| TBAB | 3.93 ± 3.33 |
| TMDDA | 4.19 ± 1.04 |
| TMOA | 3.51 ± 1.11 |
| TMDA | 8.00 ± 4.53 |
| TMHA | 1.68 ± 1.39 |
| TMHDA | 4.83 ± 0.99 |
| TMODA | 10.45 ± 3.20 |
표 2 선택한 수정된 Nafion의 폴리머 (참고 : 고정화 활동이 효소의 초기 구체적인 활동의 기능입니다)에 고정화 NAD 의존 포도당 탈수소 효소 활동..
| Nafion의 종류 | 효소 활동 (MU / g) |
| 버퍼 (없음 폴리머) | 7.18 ± 0.51 |
| Nafion (un-mod.) | 70.1 ± 0.5 |
| TMTDA | 133 ± 6 |
| TBAB | 244 ± 4 |
| TMDDA | 221 ± 6 |
| TMOA | 1.78 ± 0.63 |
| TMDA | 206 ±5 |
| TEHA | 40.1 ± 50.6 |
| TMHDA | 0 |
| TMODA | 1.45 ± 0.06 |
표 3 PQQ 종속 포도당 탈수소 효소 활동 선택한 수정된 Nafion의 폴리머 (참고 : 고정화 활동이 효소의 초기 구체적인 활동의 기능입니다)에 고정화..
| Nafion의 종류 | 효소 활동 (U / G) | ||
| 버퍼 (없음 폴리머) | 103.61 ± 3.15 | ||
| Nafion (un-mod.) | 19.93 ± 10.10 | ||
| TMTDA | 247.25 ± 12.49 | ||
| TBAB | 152.27 ± 5.29 | ||
| TMDDA | 262.05 ± 6.26 | ||
| TMOA | 129.18 ± 2.31 | TMDA | 141.23 ± 1.97 |
| TMHA | 131.75 ± 2.89 | ||
| TMHDA | 132.50 ± 1.18 | ||
| TMODA | 136.50 ± 0.96 |
. 표 4 대표 포도당 산화 효소 구체적인 활동 선택한 수정된 Nafion의 폴리머 (고정화 활동이 효소의 초기 구체적인 활동의 기능이다 메모)에 고정.
그림 1. Nafion 폴리머 및 효소 고정의 후속 사용에 TBAB의 정관의 도식.
그림 2. Nafion과 TBAB의 초기 공동 캐스트 필름의 광학 사진. 수확량에게 보를 덮고있는 투명한 밝은 갈색 필름을 건조 속도를무게 트레이의 ttom.
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Discussion
설명한 절차에 tetra-알킬의 암모늄 염은 효소를 고정하고 안정화하는 데 사용할 수 micellar 폴리머를 만드는 상용 Nafion을 수정하는 데 사용됩니다. assays는 폴리머는 활동의 높은 보존과 효소의 다양한 고정하는 데 사용할 수있는 절차 쇼에 설명되어. 관심 효소가 매우 낮은 활동이 아니면 불순한 경우, 높은 집중력이 필요할 수 있습니다 10 밀리그램 / ML 이상의 농도에서 효소를 immobilizing 않는 한 부동화 과정에 영향을 미치지 않습니다. 절차의 단순화는 더 합성 단계 (예 : 고분자 합성 또는 교차 연결하는 등) 필요하지 않습니다 점에서 다른 효소 고정 기법에서 분리시킵니다. 또한 이러한 합성 단계는 자주 단백질 변성 또는 극적으로 자신의 활동을 감소. 1mg/mL의 단백질 농도는 단순히 높은 효소를로드하기위한 제안 농도이다. 낮은 효소 농도는 항상 고용 수하지만 적은 용적 촉매 활동집니다. 효소는 디졸브로 이론적으로 높은 효소 농도는 오랫동안 사용할 수 있습니다.
폴리머는 메탄올, 에탄올, 그리고 효소와 고분자 현탁액을 혼합하면 프로파놀, 알코올의 높은 비율이 존재해야만와 같은 낮은 지방족 알콜에 용해하기 때문에. 효소 캡슐 필름 캐스팅되면 에탄올이 적시에 증발되기 때문에 대부분의 경우,이 오랫동안 같은 문제가 아닙니다. 효소는 모든 알코올 관용과 denatures에하지 않거나 수정된 Nafion 서스펜션의 추가에 따라 precipitates 경우에는이 부동화 중 하나 제한이 발생할 수 있습니다. 드문 경우에 효소가 수정된 Nafion 서스펜션과 혼합 침전물이나 변성은, 보통 효소가 변성되어와 작동하지 않습니다 나타내는 것입니다. 그것은 알콜 / 물 혼합물의 고분자를 resuspending에 의해 현탁액에 알콜 함량을 줄일 수 있습니다하지만 낮은 지방족 알콜은 resuspension 솔루션에서 상당한 농도 (> 25 %)에서 요구되므로 이러한 고정 기술은 알코올의 이러한 농도를 용인할 수 없다 효소 / 효소 솔루션이 작동하지 않습니다.
세 효소의 각과 고분자의 각 효소 assays는 솔루션에서 효소에 비해 상대적으로 구체적인 활동 동향이 효소 시스템의 기능입니다 것을 보여줍니다. 효소의 각각 다른 크기, 다른 PI, 다른 최적의 산도는 물론 PQQ 종속 포도당 탈수소 효소는 멤브레인 관련된 단백질이므로 매우 다른 화학 microenvironment 그 cytosolic 단백질을 필요로한다는 사실이기 때문에 이것은, 기대됩니다. 따라서 hydrophobically 수정된 micellar Nafion 버퍼보다 적극적인 PQQ 의존 포도당 탈수소 효소를 안정화에 대한 자세한 멤브레인 - 좋아하는 환경을 제공하고 고정화 효소의 드문 superactivity를 보여줍니다.고려해야 할 nother 문제는 폴리머 점막이 큰 분자의 수송 감소하고 포도당 (여기에 표시된 세 가지 테스트를 위해 기판)가 작고 있지만, 보조 효소 NAD는 NAD 의존 dehydrogenases위한 멤브레인에서 퇴원 확산이 필요하고 이것을 감소한다는 효소 활동을 관찰했다. 전반적으로, 그것은 각각의 효소에 필요한 정확한 폴리머 때문에 크기, 비용, 최적의 산도와 효소 시스템의 각 기판 / cofactors의 교통의 차이 때문에, 최적화되어야합니다 것이 중요합니다.
고정화 효소의 assays 이외,이 효소 고정 방식을 탐구하고 기본 응용 프로그램이 효소 biosensors과 생물 연료 전지의 제조이다. 캡슐 산화 환원 효소를 포함하는 수정된 Nafion의 폴리머가 전극 표면에 캐스팅되면 bioelectrocatalytic 프로세스 전류 resp을 생산, 적절한 기판과 cofactors의 면전에서 발생할 수onse. 수정된 Nafion과 가공 Bioanodes이 아니라 도입에서 설명한 에탄올, 메탄올, pyruvate 및 글리세롤을 이용 생물 연료 전지에 사용되었습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 해군 연구소, 유나이티드 콩 보드, 그리고 자금 지원을위한 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 사무실을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a | |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 | |
| Vortex Genie | |||
| Analytical balance |
References
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
- Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J.
- Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
- Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
- Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
- Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
- Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
- Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
- Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
- Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
- Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C.
