Nafion-Sal modificado hidrofóbico para imobilização de enzimas e Estabilização

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar um polímero micelar para imobilização e estabilização enzimática. Para isso, primeiramente, combine a suspensão de nenhum com o sal brometo de colina, e vortex a mistura para promover a troca da forma protonada do náfiom por sais de amônio. O segundo passo é secar o polímero resultante despejando a mistura em um barco de vidro e permitindo que os solventes evaporem.

Em seguida, mergulhe o polímero em água deionizada por 12 a 24 horas para remover o excesso de sal. Após a extração do sal, enxágue o polímero com água e, então, deixe o polímero secar completamente por evaporação. O passo final é transferir o polímero para um frasco limpo e ressuspendê-lo em solvente para uso na imobilização da enzima. Em última análise, este polímero para imobilização de enzimas micelares é utilizado para melhorar a estabilidade das enzimas em ensaios de atividade.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque este procedimento parece extremamente simples, mas o processo de secagem é crítico para a fabricação de um polímero funcional. O procedimento será demonstrado por shu, um estudante de pós-graduação no meu laboratório, para iniciar o processo de modificação do náfiom com sais de amônio de Nerium. Meça um excesso molar triplo em relação aos grupos ácido sulfônico no polímero de náfiom do sal brometo de alquilamônio.

Transfira o sal de brometo de alquilamônio para um vial de vidro com vigor. Agite um frasco contendo suspensão de náfiom a 5% em peso por volume por aproximadamente 30 segundos para garantir que o náfiom esteja uniformemente suspenso na solução. Pipete dois mililitros do náfiom agora ressuspenso e adicione-o ao vial de vidro contendo o sal de brometo de AGU amônio.

Vortex a ampola a 900 RPM durante 10 a 15 minutos. Em seguida, despeje a solução viscosa em uma bandeja plástica de pesagem e use uma pipeta para transferir qualquer solução residual da ampola para a bandeja de pesagem. Neste exemplo, o barquinho é parcialmente coberto e deixado sobre a bancada do laboratório para permitir que os solventes evaporem completamente da bandeja de pesagem a uma taxa de evaporação que leva mais de seis horas.

A evaporação completa de todo o solvente na taxa apropriada de evaporação deve deixar um filme transparente amarelo ou marrom no fundo da bandeja de pesagem, conforme mostrado aqui. Se o solvente evaporar muito rapidamente, formar-se-á um material crocante ou cristalino em vez de um filme transparente, indicando que a estrutura micelar do polímero foi destruída. Se a evaporação do solvente for muito lenta ou se o sal de amônio reagir por tempo excessivo e absorver vapor de água em excesso, formar-se-á um gel laranja pegajoso ou um material cristalino branco.

Em ambos os casos, o procedimento deve ser reiniciado. Após toda a evaporação do solvente na taxa apropriada, encha a bandeja de pesagem com 10 a 20 mililitros de água desionizada de 18 megohm por centímetro, cubra e deixe em repouso por 12 a 24 horas para remover os sais excedentes de brometo de alquilamônio e HBr. Doze a 24 horas depois, pipete a água e adicione água desionizada suficiente para preencher a bandeja. Tenha cuidado para sempre pipetar no sentido oposto ao filme polimérico, a fim de evitar perda do material.

Lave um total de três vezes após as lavagens. Deixe a bandeja de pesagem descoberta até que o polímero esteja completamente seco. Quando completamente seco, o polímero deve ser um filme plástico transparente e um tanto frágil.

Em contraste, polímeros que não foram secos adequadamente terão uma aparência muito diferente após a extração do sal, conforme mostrado aqui. Com uma espátula, remova cuidadosamente o filme seco da bandeja de pesagem e transfira-o para um vial de vidro limpo. Adicione dois mililitros de etanol e três esferas cerâmicas de mistura e vortexe por quatro horas ou até que o filme polimérico seja completamente ressuspenso.

A solução de nathe modificada com alquilamônio está agora pronta para ser usada na imobilização enzimática. Se a enzima a ser imobilizada for uma enzima seca, pese um miligrama da enzima em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e adicione um mililitro de tampão fosfato cem milimolar pH sete para criar uma solução enzimática de um miligrama por mililitro. Transfira 120 microlitros da solução enzimática de um miligrama por mililitro para um novo tubo.

Adicione 60 microlitros da solução de nafion modificado com amônio ALK e vortexie por 10 segundos. A proporção entre enzima e solução polimérica deve ser mantida em dois para um, caso esta mistura precise ser ampliada para um grande número de réplicas. Por fim, pipete 60 microlitros da solução de enzima-polímero no fundo de cada uma das três cubetas separadas de um centímetro quadrado e deixe secar durante a noite.

A estabilidade da enzima dentro do filme polimérico pode então ser avaliada por ensaios de atividade enzimática, conforme demonstrado. A seguir, para iniciar este ensaio, adicione os seguintes reagentes ao tubo contendo o copo com o polímero nafion modificado e a enzima desidrogenase dependente de NAD: 1,3 mililitros de pirofosfato de sódio 50 milimolar, 1,5 mililitros de nicotinamida adenina dinucleotídeo 15 milimolar recém-preparado ou NAD e 0,1 mililitro de água.

Coloque o vete em um espectrofotômetro UV-visível ajustado para um comprimento de onda de 340 nanômetros. Adicione 0,1 mililitros de etanol ao vete e misture os reagentes pipetando suavemente a solução para cima e para baixo cinco vezes; para o branco, utilize 0,1 mililitros de água adicional em vez dos 0,1 mililitros de etanol. Cinco minutos após a adição dos reagentes ao vete, registre a absorbância em 340 nanômetros.

Registre a absorbância novamente 20 minutos após a adição dos reagentes ao qve; esses dois pontos de dados serão plotados para obter uma inclinação que pode ser usada nos cálculos de atividade para ensaiar a atividade enzimática específica do pq imobilizado. Pipete esses reagentes no qve co-cast com o polímero de nafion modificado e a desidrogenase dependente de PQQ. 1,5 mililitro de fosfato de sódio e 200 microlitros de sulfato de pH metílico 600 micromolar ou PMS.

Coloque o vete em um espectrofotômetro UV-visível ajustado para um comprimento de onda de 600 nanômetros e zero. O espectrômetro adiciona 100 microlitros de uma mistura de 700 microlitros de cloreto de fenazina ou DCIP e 200 microlitros do substrato de interesse. Misture os reagentes pipetando suavemente a solução para cima e para baixo cinco vezes para um branco.

Utilize 200 microlitros de água em vez do substrato de interesse. Cinco minutos após a adição dos reagentes, registre a absorbância em 600 nanômetros.

Registre a absorbância novamente 20 minutos após a adição dos reagentes para iniciar este ensaio. Adicione à Q VET co-cast com o polímero de náfião modificado e glicose oxidase. Dois mililitros de uma solução contendo os seguintes componentes: ácido para-hidroxibenzóico 0,2 molar, azida de sódio 0,02%, peroxidase 128 unidades, quatro aminoantipirina 0,3 milimolar, fosfato de potássio 1 molar e glicose 50 milimolar.

Prepare a solução pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Coloque o Q vet em um espectrofotômetro UV-visível ajustado para um comprimento de onda de 510 nanômetros. Cinco minutos após os reagentes terem sido adicionados ao qve.

Registre a absorbância em 510 nanômetros. Em seguida, registre novamente a absorbância após 20 minutos da adição dos reagentes. Esta tabela mostra os resultados do ensaio da atividade da glicose desidrogenase dependente de NAD imobilizada e de polímeros de náfiom modificados selecionados.

Observou-se que a glicose desidrogenase dependente de NAD imobilizada apresentava uma atividade específica menor do que a da solução enzimática e tampão. Isso ocorre porque as membranas poliméricas reduzem o transporte de moléculas grandes, e embora a glicose, substrato do ensaio, seja pequena, o coenzima NAD precisa difundir-se para dentro e para fora da membrana. Para a desidrogenase dependente de NAD, a limitação de transporte devida à imobilização no polímero diminui a atividade enzimática observada.

A próxima tabela mostra os resultados de ensaios da atividade da desidrogenase da glicose dependente de PQQ imobilizada em polímeros de nafion modificados e selecionados. É importante observar aqui a maior atividade das enzimas imobilizadas na maioria dos filmes de nafion em comparação com as enzimas em solução tampão. Como a desidrogenase da glicose dependente de PQQ é uma proteína associada à membrana, o nafion modificado hidrofóbico fornece um ambiente mais semelhante à membrana do que o tampão, estabilizando assim a desidrogenase da glicose dependente de PQQ ativa e, consequentemente, aumentando a atividade da enzima.

Por fim, os resultados representativos do ensaio de atividade específica da glicose oxidase. Polímeros de náfiom modificados imobilizados e selecionados são mostrados nesta tabela. Os ensaios enzimáticos para cada um dos polímeros com cada uma das três enzimas mostram que as tendências na atividade específica relativa, comparadas à enzima em solução, são uma função do sistema enzimático.

Consequentemente, o polímero exato necessário para cada enzima precisa ser otimizado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a etapa de secagem é crítica para este procedimento específico.