Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.
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Artigo de método
A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) foram utilizados para estabelecer células-tronco embrionárias (hESCs) culturas após blastocisto isolamento 1. Este sistema de alimentação mantém hESCs de sofrer diferenciação espontânea durante a expansão de células. No entanto, este método de co-cultura é um trabalho intensivo, requer pessoal altamente treinado, e os rendimentos a pureza hESC baixo 4. Muitos laboratórios têm tentado minimizar o número de células de alimentação em culturas CTEh (isto é, a incorporação da matriz revestidos pratos ou outros tipos de células alimentadoras 5-8). Estes sistemas de cultura modificados têm mostrado alguma promessa, mas não suplantou o método padrão para hESCs cultura com mitomicina C tratados com fibroblastos de rato embyronic a fim de retardar a diferenciação espontânea indesejada das culturas CTEh. Portanto, as células de alimentação utilizados na expansão hESC deve ser removido durante as experiências de diferenciação. Embora várias técnicas disponíveis para a purificação do co hESClonies (FACS, Macs, ou o uso de vetores resistentes aos medicamentos) de alimentadores, estas técnicas são de trabalho intensivo, caro e / ou destruidores para o hESC. O objetivo deste projeto foi o de inventar um método de purificação que permite a colheita de uma população mais pura de hESCs. Temos observado que em uma cultura confluente hESC, a população MEF pode ser removido usando uma aspiração simples e rápida da folha de MEF. Esta remoção é dependente de vários factores, incluindo a ligação de célula-a-célula lateral MEFs que tem uma menor afinidade de ligação para o prato de cultura de estireno, e a capacidade de as colónias de células-tronco para empurrar para fora os fibroblastos durante a geração do seu próprio " nicho ". O hESC foram então examinadas para SSEA-4, Oct3 / 4 e expressão Tra 1-81 até 10 dias após a remoção do MEF para assegurar a manutenção da pluripotência. Além disso, as colônias CTEh foram capazes de continuar crescendo de em formações maiores após a remoção do MEF, proporcionando um nível adicional de expansão hESC.
Protocolo
1. Preparação de Alimentadores embrionárias de rato
- O MEFs utilizado na co-cultura de hESCs devem ser previamente tratadas por irradiação ou mitomicina C para inibir as células de sofrer divisão.
- Duas horas antes da semeadura MEF, revestimento de plasma 60 milímetros cada prato de cultura tratada com 2 ml de 0,05% de gelatina.
- Descongelar um frasco de MEFs tratada e da placa de ~ 20.000 células / cm 2.
- Permitir que as células a aderir durante a noite.
2. Co-semeadura hESCs em MEFs
- Novas colônias pode ser iniciada a partir de culturas criopreservados ou passagens em cultu....
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Discussão
O método apresentado neste manuscrito oferece uma alternativa rápida e menos onerosa para eliminar células alimentadoras de fibroblastos humanos de culturas de células embrionárias. A eliminação bem sucedida de fibroblastos é dependente da existência de uma monocamada confluente de firmemente estas células que se desenvolvem em culturas de células estaminais mais longos. Depois de 7-10 dias, as colónias que crescem CTEh vai empurrar os fibroblastos de alimentação numa direcção para fora, gerando uma monocamada de fibrob.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma Nova Faculdade Prêmio II do California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e um NIH-financiado Prêmio Nacional de Pesquisa (F32-HL104924)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Marcador de fibroblastos |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Marcador Núcleo Celular |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Humana ESC Marcador |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Humana ESC Marcador |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Marcador de diferenciação precoce |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Humana ESC Marcador |
Tabela 1. Tabela de rea específicagents utilizado para a imunocoloração o hESC.
Referências
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blas....
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