Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Summary

Neste artigo, um método de produção elevada é apresentada para a síntese de oligossacáridos e à sua fixação à superfície de nanopartículas de polianidrido para utilização posterior em alvejar receptores específicos em células apresentadoras de antigénio.

Abstract

Abordagens transdisciplinares envolvendo áreas como design de materiais, nanotecnologia, química e imunologia tem que ser utilizado para projetar racionalmente portadores eficazes vacinas. Nanopartículas baseadas em plataformas pode prolongar a persistência de antígenos vacinais, que poderia melhorar a imunogenicidade da vacina ^1. Vários polímeros biodegradáveis ​​têm sido estudados como veículos de entrega de vacinas ^1, em particular, as partículas de polianidrido demonstraram a capacidade para proporcionar uma libertação sustentada de antigénios de proteínas estáveis ​​e para activar as células apresentadoras de antigénio e modulam as respostas imunes ^2-12.

A concepção molecular destes transportadores de vacina necessita de integrar a selecção racional de propriedades do polímero, bem como a incorporação de agentes adequados de segmentação. Fabricação de alta taxa de transferência automatizado de segmentação ligantes e partículas funcionalizados é uma poderosa ferramenta que irá melhorar a capacidade de estudar uma variedade rAnge de propriedades e irá conduzir à concepção de dispositivos de entrega de vacinas reprodutíveis.

A adição de segmentação ligandos capazes de serem reconhecidos por receptores específicos em células imunes tem sido demonstrado que modulam e adaptar as respostas imunes ^10,11,13 receptores de tipo C-lectina (CLRs) são receptores de reconhecimento de padrões (PRRS) que reconhecem hidratos de carbono presentes no superfície de agentes patogénicos. A estimulação de células do sistema imunológico através de CLRs permite para a internalização melhorada do antigénio ea apresentação subsequente para a activação das células T adicional ^14,15. Portanto, as moléculas de hidratos de carbono têm um papel importante no estudo das respostas imunitárias, no entanto, a utilização destas biomoléculas frequentemente sofre da falta de disponibilidade de estruturalmente bem definida e hidratos de carbono puros. Uma plataforma de automação com base na solução iterativa de fase-reacções podem permitir a síntese rápida e controlada destas moléculas sinteticamente desafiantes utilizando b significativamente menoruilding quantidades de blocos do que as tradicionais métodos de fase sólida ^16,17.

Descrevemos aqui um protocolo para a síntese de solução de fase-automatizado de oligossacáridos, tais como manose baseados ligandos de segmentação com extracção de fase sólida para a purificação fluorosa intermédia. Após o desenvolvimento de métodos automatizados para tornar o agente de hidrato de carbono com base de segmentação, que descrevem métodos para a sua fixação sobre a superfície do polianidrido nanopartículas empregando um conjunto automatizado robótico até operado por LabVIEW como descrito anteriormente ^10. Funcionalização da superfície com hidratos de carbono tem demonstrado eficácia na segmentação CLRs ^10,11 e aumentando o rendimento do método de fabricação para descobrir as complexidades associadas com um sistema de multi-paramétricos será de grande valor (Figura 1a).

Protocol

1. Alta capacidade de síntese de carboidratos

1. Antes da síntese automatizada de dimannoside, um dador de açúcar adequadamente protegido, tipicamente tricloroacetimidato, e aceitador, principalmente álcool uma alcenilo fluorosa, são sintetizados no banco-top.
2. Um programa é escrito para a síntese automatizada de dimannoside. Uma representação esquemática do procedimento básico automatizado é apresentada na Figura 2. No programa, é assegurado que, antes da adição do promotor, a mistura de dador e aceitador é agitada durante pelo menos 30 min.
3. As soluções do sintética doador aceitador, e trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate são feitas em diclorometano. Tolueno e diclorometano, são usados ​​mais freqüentemente para as reações de glicosilação.
4. Além disso, preparar soluções de reagentes para a desprotecção de grupos protectores temporários em metanol a 80% e metanol a 100%.
5. Antes do início do programa, assegurar que o Relative humidade da sala é de 30% ou inferior na câmara de automação. A alta umidade é prejudicial para as reações de glicosilação.
6. Uma vez que o programa é iniciado, o braço robótico transfere as soluções de dador e aceitador para dentro do frasco de reacção sequencialmente. Em seguida a mistura é agitada durante 30 min.
7. Em seguida, o braço robótico transfere 0,2 a 0,3 equivalentes de trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate na mistura, tipicamente à temperatura ambiente, embora temperaturas mais baixas como -20 ° C pode ser alcançada. A mistura de reacção é agitada durante 30 min.
8. Após 30 min, a reacção é parada e uma pequena alíquota removido para monitorizar o progresso da reacção. Se não está completa, a reacção pode ser continuada e, finalmente, o tempo necessário pode ser modificado.
9. Uma vez que a reacção está completa, a mistura de reacção é transferida para os fluorosas extracção de fase sólida (FSPE) cartuchos contendo C ₈ F _{17-modificado} de gel de sílica para a purificação.
10. O carrinhocristas são primeiro lavado com uma mistura de 80% de metanol-água (8 mL) para se livrar da fracção não-fluorosa.
11. Em seguida, os cartuchos são lavados com metanol a 100% para se obter o produto desejado fluorosa-etiquetado. Se purificação adicional for desejado, a máquina pode ser interrompido eo produto da reacção (s) removido para purificação por meios adicionais.
12. Após o ciclo de purificação, o braço robótico dispensa metóxido de sódio para dentro do frasco de reacção. A reacção é agitada durante 2 hr. Se não está completa, a reacção pode novamente ser continuado durante um período mais longo e, finalmente, o tempo programado necessário pode ser modificado.
13. Após a conclusão da reacção, o produto é purificado por FSPE e, em seguida, submetido a dissolução em tolueno anidro seguido de evaporação para remover a água residual.
14. Em seguida, o ciclo (do passo 6 a 13) é repetido até que o comprimento da cadeia desejada é obtida para a molécula alvo.
15. O produto protegido obtido a partir de automação é then ainda purificado e caracterizados por técnicas tais como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Desprotecção completa (remoção de todos os grupos protectores restantes) da molécula alvo final é então completado fora da plataforma de automação como uma regra, pois que normalmente envolve o gás de hidrogénio explosivo e paládio. O passo de desprotecção final foi realizada no banco de cima para fora da plataforma de automação. O primeiro passo foi ozonólise da ligação dupla em tag fluorosa seguido por oxidação do aldeído produzido para um ácido carboxílico. O produto foi purificado por cromatografia em coluna. O passo final foi desprotecção de grupos éter benzílico por paládio catalisada-hidrogenação. O produto foi passado através de celite almofada para se livrar do paládio para obter produto final puro.

2. Alta capacidade funcionalização da superfície de nanopartículas

1. Alta capacidade de síntese de polímeros e fabricação de nanopartículas é realizada após a mesma protocol e robótico configurar descrito por Petersen et al ^19. Os sistemas de copolímero utilizado para a fabricação de partículas são à base de ácido sebácico (SA) e 1,6-bis (para-carboxifenoxi)-hexano (CPH), e 1,8-bis ( para-carboxifenoxi) -3,6 dioxaoctane-(CPTEG) e CPH. Uma representação esquemática do aparelho de deposição robótico utilizada é apresentada na Figura 1b.
2. Após a fabricação de nanopartículas, o detentor contendo os tubos com a biblioteca de nanopartículas é recolocado para a fase do actuador linear.
3. Para a fixação de hidratos de carbono para a superfície de partículas de polianidrido, uma amina-carboxílico reacção de acoplamento ácido ²⁰ constituído por duas reacções consecutivas é executada.
4. Para a reacção em primeiro lugar, a seringa na bomba de seringa primeiro programável é preenchido com 10 equivalentes (eq.) (equivalentes de concentração de ácido carboxílico molar média sobre a superfície da partícula) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-cacloridrato rbodiimide (EDC) e 10 eq. de etilenodiamina em uma solução aquosa, enquanto que a seringa na bomba de seringa segundo programável é carregado com 12 eq. de N-hidroxissuccinimida (NHS) em solução aquosa.
5. Usando o programa LabVIEW, suspensões reagentes são depositadas na * biblioteca de nanopartículas.
6. Em seguida, cada amostra é sonicada (30 s em 40 Hz) e do suporte do tubo é separada a partir da plataforma robótico.
7. As suspensões de nanopartículas são incubadas durante 9 ** h com rotação constante a 4 ° C.
8. Após o tempo de reacção é completado, os tubos são centrifugados (12000 xg durante 5 min) e voltou para a estação de robótico para realizar duas etapas de lavagem.
9. Para a lavagem, uma seringa permanece vazio e carregado na bomba de seringa primeiro programável enquanto a seringa na bomba de seringa segundo é enchido com água fria. O sobrenadante de cada tubo é retirada para a seringa vazia e os depósitos segunda bomba de água fria.
10. Homogeneização de nanosuspensão de partículas é realizada como descrito no passo 2.6. Os tubos são em seguida centrifugada (12000 xg durante 5 min) e um segundo passo de lavagem é realizada como descrito no passo 2.9.
11. Para a reacção segundo, dois passos de deposição são utilizados. Na etapa de deposição em primeiro lugar, 12 eq. de EDC são carregados com uma bomba e 12 eq. NHS de são carregados com a segunda bomba.
12. O passo de deposição segundo inclui 10 eq. de um sacárido específica sobre as bombas primeiro e segundo (isto é, galactose, lactose ou di-manose) *** e uma terceira bomba com 10 eq. de ácido glicólico (usado como controlo ****).
13. As suspensões de nanopartículas é homogeneizada como descrito na etapa 2,6 e incubou-se durante 9 h, com rotação constante a 4 ° C.
14. Após o tempo de reacção é completada, um passo de lavagem é realizada como descrito nos passos 2.8, 2.9 e 2.10.
15. A biblioteca de nanopartículas funcionalizado é então colocado numa câmara de vácuo para secar durante pelo menos 2 horas.
16. As nanopartículas são funcionalizados em seguida carácterzada por espectroscopia de raios X de fotoelétrons e um ensaio de ácido elevada taxa de transferência de fenol-sulfúrico para determinar a composição da superfície e da concentração do sacárido respectivamente. Microscopia electrónica de varrimento e de dispersão de luz dinâmica são utilizados para determinar o tamanho de partícula, distribuição de tamanho, e carga de superfície.

Notas: * Os volumes de deposição variar de acordo com a massa de nanopartículas contidas em cada tubo.
Vezes ** reaccionais para reacções primeiro e segundo pode ser alterado para ajustar a concentração de sacárido final.
Cada *** sacárido é depositado em tubos de ensaio, dependendo do grupo desejado.
**** Para a reacção específico empregue neste estudo para a ligação de hidratos de carbono, o ácido glicólico é usado como um controlo linker desde sacáridos desprotegidos já têm esta molécula ligada covalentemente, que permite a fixação adicional para a superfície de nanopartículas.

3. Os resultados representativos

O fuldimannoside ly protegido mostrado na Figura 2 foi sintetizado utilizando a plataforma de automação. O composto sintetizado foi caracterizado por ¹ H RMN num espectrómetro de VXR 400 MHz usando _CDCI3 como solvente. O espectro de RMN é mostrado na Figura 3.

Utilizando a fabricação de nanopartículas de alto rendimento e funcionalização de polianidrido nanopartículas aqui descrito, a ligação de dimannose, lactose e galactose foi realizada com sucesso ^{10, 11.} Utilizando esta configuração, as condições reaccionais óptimas (isto é, temperatura de reacção e tempo) foram identificados para atingir funcionalização de nanopartículas desejado e morfologia. Quando a reacção foi realizada a 4 ° C em vez de temperatura ambiente, uma redução na agregação de nanopartículas foi observada por SEM (dados não mostrados). A Tabela 1 mostra os resultados representativos da caracterização de CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas CPH quer com di-manose oulactose, sintetizado a 4 ° C. Os dados indicam um pequeno aumento no diâmetro médio de nanopartículas devido à funcionalização. Enquanto as nanopartículas não-funcionalizados tinha um potencial zeta negativo de aprox. -20 MV, as partículas funcionalizadas mostrou um valor de potencial zeta positivo, demonstrando funcionalização bem sucedida da superfície de nanopartículas. Lactose e di-manose são ambos açúcares neutros, no entanto, os grupos amina livres do etileno diamina ligante utilizado para fixar os sacáridos podem ser responsáveis ​​do potencial zeta positivo.

Tempo de reacção é outra variável que pode afectar tanto morfologia do final das nanopartículas e do grau de ligação alcançados açúcar. Ao ajustar o tempo de reacção, a concentração final de açúcar ligada à superfície nanopartículas podem ser controladas, como mostrado na Figura 4A. Como esperado, a concentração de dimannose sobre a superfície de 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas aumentou como tempo total de reacção e atingiu um máximo após 18 h. As nanopartículas funcionalizados com o tempo de reacção total de 24 hr foram utilizados para avaliar a sua capacidade para atingir CLRs no rato derivadas da medula óssea células dendríticas (DC). A citometria de fluxo foi utilizado para avaliar a expressão de dois receptores de CL (isto é, CIRE (CD209, DC-SIGN) e receptor de manose (CD206)) após estimulação com não-funcionalizado, e lactose, e di-manose nanopartículas funcionalizadas (Figura 4B). Uma maior expressão de ambos os receptores, que é um indicativo de direccionamento eficaz, foi obtido quando as células foram estimuladas com ambos lactose e di-manose nanopartículas funcionalizados. No entanto, di-manose-funcionalizados partículas mostraram um maior nível de expressão indicando uma especificidade deste ligando para os receptores que foram estudados.

Tipo de nanopartícula	Diâmetro médio de partícula (nm)	AvePartículas raiva ζ-potencial (mV)
Non-funcionalizado	162 ± 43	-20 ± 0,6
Lactose	235 ± 34	26 ± 2,4
Di-manose	243 ± 32	30 ± 4,2

Tabela 1. Caracterização de nanopartículas. Non-funcionalizado e funcionalizado foram caracterizados por quasi-elástica de dispersão de luz e as medições de potencial zeta. Dados de tamanho de partículas representam o valor médio ± desvio padrão (SD) de dados dinâmicos de espalhamento de luz coletados em três experimentos independentes. Dados de potencial zeta representam o valor médio ± DP de três leituras independentes. Mudança no sinal do potencial zeta demonstra que o açúcar era eficiente conjugado com o CPTEG 50:50: superfície de nanopartículas CPH.

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Figura 1. (A) representação gráfica da abordagem prosseguido com funcionalização hidrato de carbono de nanopartículas polianidrido e um exemplo das bibliotecas de nanopartículas funcionalizados que poderiam ser concebidos com o descrito abordagem de alto rendimento. (B) representação esquemática do aparelho de deposição automatizado utilizado para funcionalização de partícula, que consiste de (i) três NE 1000 bombas, (ii) uma fase robótico integrado por dois actuadores (Zaber): um para o movimento na direcção X ea outra para o movimento na direcção y, (iii) um segundo estágio robótico com duas cremalheiras adjacentes (adequado para os tubos e tinas) que consiste em três actuadores, um para cada direcção (x, y, ez). As bombas e um total de cinco actuadores estão ligados em série. Atuadores e bombas são operados por um computador utilizando o software LabVIEW. Este diagrama não está em escala.arge.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

Figura 2. Representação gráfica da automatizado iterativo síntese de hidratos de carbono, usando manose como um exemplo.

Figura 3. ¹ H RMN do dimannoside protegido.

Figura 4. (A) Efeito do tempo de reacção sobre a concentração de nanopartículas de superfície de sacárido. Nos dados mostrados, 50:50 CPTEG: nanopartículas CPH foram funcionalizados com dimannose em diferentes tempos de reacção ea reacção foi realizada a 4 ° C. O erro médio e padrão de duas experiências independentes de funcionalização é mostrado. (B) nanopartículas lactose e di-manose funcionalizadoseficazmente receptor alvo DC-SIGN (CIRE, CD209) e manose (CD206) em derivadas da medula óssea células dendríticas, como demonstrado pelo aumento da expressão destes dois marcadores após estimulação com CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas CPH, quando comparado com a expressão obtida com não-funcionalizados partículas.

Discussion

A eficácia de hidratos de carbono como agentes de segmentação a interacções de nanopartículas directos para células do sistema imunológico foi anteriormente demonstrada ^{10, 11.} Uma pesquisa anterior nos nossos laboratórios têm mostrado que os açúcares específicas associadas a nanopartículas polianidrido são capazes de atingir CLRs diferentes em células apresentadoras de antigénio (APCs), aumentando assim a activação de células imunitárias que pode ser importante para a activação das células T adicional ^1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de Catálogo
Motorizado Stage XYZ: 3x T-LSM050A, 50 viagens mm por eixo	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Bomba de seringa	Sistemas de bomba nova Era	NE-1000
Pyrex * Vista * sem aro tubos de cultura de vidro reutilizáveis	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Technologies
LabVIEW	National Instruments	776671-35
Seringas SGE estanque aos gases Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
XL-2000 sonicador	Qsonica	Q55
Mini-tubo rotador	Fisher Scientific	05-450-127